Изоляция и скрининг из биоразнообразия почв на грибы, участвующие в деградации непокорных материалов
Summary
Здесь мы представляем протокол скрининга биоразнообразия почв для поиска грибковых штаммов, участвующих в деградации непокорных материалов. Сначала выделяют грибковые штаммы, способные расти на гуминовых кислотах или лигноцеллюлозе. Затем их активность проверяется как в ферментативных анализах, так и на загрязняющих веществах, таких как углеводороды и пластмассы.
Abstract
Загрязнение окружающей среды является растущей проблемой, и выявление грибов, участвующих в процессе биоремедиации, является важной задачей. Почва содержит невероятное разнообразие микробной жизни и может быть хорошим источником этих биоремедиативных грибов. Эта работа направлена на поиск почвенных грибов с потенциалом биоремедиации с использованием различных скрининговых тестов. Минеральные питательные среды, дополненные непокорными веществами в качестве единственного источника углерода, использовались в качестве тестов на рост. Сначала разбавления почвы покрывали на чашках Петри минеральной средой, дополненной гуминовыми кислотами или лигноцеллюлозой. Растущие колонии грибов были выделены и испытаны на различных субстратах, таких как сложные смеси углеводородов (вазелин и отработанное моторное масло) и порошки различных пластиковых полимеров (ПЭТ, ПП, ПС, ПУР, ПВХ). Качественные ферментативные тесты были связаны с тестами роста для исследования производства эстераз, лакказ, пероксидаз и протеаз. Эти ферменты участвуют в основных процессах деградации непокорного материала, и их конститутивная секреция исследуемыми грибковыми штаммами может иметь потенциал для использования для биоремедиации. Было выделено и протестировано более 100 штаммов, обнаружено несколько изолятов с хорошим потенциалом биоремедиации. В заключение, описанные скрининговые тесты являются простым и недорогим методом выявления грибковых штаммов с потенциалом биоремедиации из почвы. Кроме того, можно адаптировать скрининговые тесты для различных загрязняющих веществ в соответствии с требованиями, добавляя другие непокорные вещества в минимальные питательные среды.
Introduction
Почва является фундаментальным компонентом жизни на Земле и является основой многих экосистем. Минералы, органические вещества и микроорганизмы в почве можно рассматривать как одну систему, между которой происходят тесные ассоциации и взаимодействия. Взаимодействие этих соединений оказывает важное влияние на наземные процессы, качество окружающей среды и здоровье экосистем1. Загрязнение почв создает серьезные экологические проблемы во всем мире. Неизбирательное, долгосрочное и чрезмерное применение непокорных и токсичных веществ, таких как пестициды, нефтепродукты, пластмассы и другие химические вещества, оказывает серьезное воздействие на экологию почвы и, как следствие, может изменить микробиоту почвы. Микробные сообщества в почвах состоят из широкого спектра организмов в различных физиологических состояниях, большинство из которых являются бактериями и грибами. Многие из загрязняющих веществ в почвах имеют средне- и долгосрочную стабильность, и их стойкость может привести к развитию адаптивных механизмов, позволяющих микроорганизмам использовать непокорные вещества в качестве питательных веществ 2,3. Поэтому эти микроорганизмы могут рассматриваться для методов биоремедиации.
Биоремедиация пытается смягчить последствия загрязнения путем использования микроорганизмов и их ферментов для деградации или превращения отходов в менее токсичные или нетоксичные соединения. Различные виды архей, бактерий, водорослей и грибов обладают этой способностью биоремедиации4. В результате своего особого биодеградативного действия грибы являются особенно перспективными организмами для биоремедиации. Они могут атаковать различные субстраты, используя свою гифальную сеть, что позволяет им проникать в почвенную матрицу более эффективно, чем другие микроорганизмы. Кроме того, они могут достигать недоступных промежутков, где загрязняющие вещества трудно удалить5, и они также могут выдерживать низкий уровень влажности6. Кроме того, грибы синтезируют различные кассеты неспецифических ферментов, как правило, для разложения природных непокорных веществ, таких как целлюлоза, лигнин и гуминовые кислоты. Те, у кого отсутствует целевой субстрат, могут быть вовлечены в деградацию широкого спектра непокорных загрязнителей, таких как углеводороды, пластмассы и пестициды 7,8,9,10. Поэтому, хотя многие виды грибов уже были зарегистрированы в качестве агентов биоремедиации, растет интерес к изучению видов, которые еще не были изучены, для отбора кандидатов на биоремедиацию непокорных загрязняющих веществ. Уже известные виды, обладающие биоремедиационными свойствами, принадлежат к типу Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 и Mucoromycota. Например, хорошо известно, что роды Penicillium и Aspergillus участвуют в деградации алифатических углеводородов13, различных пластиковых полимеров 16,17,18, тяжелых металлов 19 и красителей20. Аналогичным образом, исследования, проведенные на грибах базидиомицетов, таких как Phanerochaete chrysosporium и Trametes versicolor, выявили их участие в окислении непокорных материалов, таких как ароматические углеводороды13 и пластмассы21. Другим примером грибов, участвующих в процессах биодеградации, являются зигомицеты Rhizopus spp., Mucor spp. и Cunninghamella spp.22,23. В частности, Cunninghamella способна окислять ароматические углеводороды и считается модельным организмом для изучения детоксикации продуктов из широкого спектра ксенобиотиков13.
Существует несколько грибковых ферментов, участвующих в основных деградативных процессах непокорных материалов24,25, таких как эстераза, лакказа, пероксидаза и протеаза. Лакказы представляют собой медьсодержащие оксидазы, вырабатываемые в клетке и впоследствии секретируемые, которые позволяют окислять различные фенольные и ароматические соединения. Они могут разлагать орто- и парадифенолы, аминогруппсодержащие фенолы, лигнин и арильную группу, содержащие диамины26. Пероксидазы используют перекись водорода в качестве медиатора для разложения лигнина и других ароматических соединений. Существует много различных пероксидаз, но те, которые обладают наибольшим потенциалом для разложения токсичных веществ, – это лигнинпероксидаза и пероксидаза марганца27.
Эстеразы и протеазы относятся к группе экстра- или эктоклеточных ферментов, которые действуют вне клеток своего происхождения, но все еще связаны с ними. Эти ферменты могут катализировать гидролиз больших непокорных молекул в более мелкие. Благодаря низкой субстратной специфичности эти ферменты могут играть ключевую роль в биоремедиации различных загрязняющих веществ, таких как текстильные красители, стоки, выделяемые из целлюлозно-бумажной промышленности и кожевенного дубления, нефтепродукты, пластмассы и пестициды 28,29,30.
Уже опубликован ряд методов скрининга для отбора биоремедиативных грибковых штаммов. Например, агаровая среда на основе соломы использовалась для скрининга грибов белой гнили с высоким потенциалом деградации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ)31; и небольшие кусочки гниющей древесины были помещены на агар экстракта солода (MEA) для изоляции гниющих грибов32. Однако большинство методов, которые уже были предложены, отбирают очень специфические грибы для их интересующей деятельности. Это исследование предлагает более широкий подход к выбору почвенных грибов с более широким спектром действия. Метод основан на первоначальном нанесении серийных разбавлений образцов почвы на среду, дополненную гуминовыми кислотами или лигноцеллюлозой, смешанной с антибиотиками, для отбора грибов, обладающих способностью разлагать эти природные непокорные вещества. Гуминовые кислоты и лигноцеллюлоза, по сути, являются веществами, которые чрезвычайно устойчивы к биодеградации, так как имеют очень сложные молекулярные структуры, и это позволяет им быть отличными показателями деградативной способности испытуемых грибов33,34. Впоследствии грибы, отобранные в первых тестах, проверяются для выявления грибов, способных разлагать конкретные загрязняющие вещества, такие как вазелин, отработанное моторное масло и пластмассы. Наконец, проводятся качественные ферментативные тесты для выявления грибковых штаммов, способных продуцировать ферменты, участвующие в процессах биодеградации непокорных веществ. С этой целью проводятся протеазные и эстеразные тесты, при этом галловая кислота и гваякол используются в качестве индикаторов выработки лакказы и других лигнинолитических ферментов35,36. Эти субстраты используются, потому что была обнаружена сильная корреляция между способностью грибов окислять их до их коричневой формы и обладанием лигнинолитической способностью 37,38,39.
С помощью этих протоколов можно выделять грибковые штаммы с высоким деградативным потенциалом и широким спектром действия непосредственно из образцов почвы. Выделение этих грибковых штаммов может помочь найти новых кандидатов для целей биоремедиации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Богатое биоразнообразие почвы является обильным источником грибов, которые обладают многочисленными метаболическими способностями, некоторые из которых могут быть потенциальными кандидатами на биоремедиацию. Селективные испытания сред (раздел 1 протокола) являются простыми в выпол…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем признательность Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) из Университета Павии и профессору Сольвейгу Тоси за предоставление возможности для этой работы.
Materials
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
- Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
- Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation – A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
- Dix, N. J., Webster, J. . Fungal Ecology. , (1995).
- Magan, N., Esser, K., Lemke, P. A. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. 4, 99-114 (2007).
- Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
- Hasan, I. F., AI-Jawhari, V., Kumar, M., Kumar, R., Prasad, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. , (2018).
- Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
- Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
- Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
- Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
- Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 1-36 (2018).
- Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig’s Corrosion Handbook. , 421-438 (2011).
- Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, 224-239 (2019).
- DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
- El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
- Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
- Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
- Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
- Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
- Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
- Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
- Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , (2019).
- Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
- Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , (2019).
- Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
- Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
- Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
- Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
- Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
- Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
- Stevenson, F. J. . Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , (1995).
- Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
- Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
- Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
- Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
- Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
- Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
- Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
- Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
- Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
- Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
- Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).
