Isolement et dépistage de la biodiversité du sol à la recherche de champignons impliqués dans la dégradation des matériaux récalcitrants
Summary
Nous présentons ici un protocole de criblage de la biodiversité des sols afin de rechercher les souches fongiques impliquées dans la dégradation des matériaux récalcitrants. Tout d’abord, les souches fongiques capables de se développer sur les acides humiques ou la lignocellulose sont isolées. Leur activité est ensuite testée à la fois dans des essais enzymatiques et sur des polluants tels que les hydrocarbures et les plastiques.
Abstract
La pollution de l’environnement est un problème croissant, et l’identification des champignons impliqués dans le processus de bioremédiation est une tâche essentielle. Le sol abrite une incroyable diversité de vie microbienne et peut être une bonne source de ces champignons biorémédiateurs. Ce travail vise à rechercher des champignons du sol ayant un potentiel de bioremédiation en utilisant différents tests de dépistage. Des milieux de culture minéraux complétés par des substances récalcitrantes comme seule source de carbone ont été utilisés comme tests de croissance. Tout d’abord, les dilutions du sol ont été plaquées sur des boîtes de Pétri avec un milieu minéral amendé avec des acides humiques ou de la lignocellulose. Les colonies fongiques en croissance ont été isolées et testées sur différents substrats, tels que des mélanges complexes d’hydrocarbures (vaseline et huile moteur usagée) et des poudres de différents polymères plastiques (PET, PP, PS, PUR, PVC). Des tests enzymatiques qualitatifs ont été associés aux tests de croissance pour étudier la production d’estérases, de laccases, de peroxydases et de protéases. Ces enzymes sont impliquées dans les principaux processus de dégradation du matériel récalcitrant, et leur sécrétion constitutive par les souches fongiques examinées pourrait avoir le potentiel d’être exploitée pour la bioremédiation. Plus de 100 souches ont été isolées et testées, et plusieurs isolats présentant un bon potentiel de bioremédiation ont été trouvés. En conclusion, les tests de dépistage décrits sont une méthode facile et peu coûteuse pour identifier les souches fongiques ayant un potentiel de bioremédiation du sol. En outre, il est possible d’adapter les tests de dépistage pour différents polluants, en fonction des besoins, en ajoutant d’autres substances récalcitrantes à des milieux de culture minimaux.
Introduction
Le sol est une composante fondamentale de la vie sur Terre et est à la base de nombreux écosystèmes. Les minéraux, la matière organique et les micro-organismes dans le sol peuvent être considérés comme un seul système, avec des associations et des interactions étroites se produisant entre eux. Les interactions de ces composés ont un impact important sur les processus terrestres, la qualité de l’environnement et la santé des écosystèmes1. La pollution des sols pose de graves problèmes environnementaux dans le monde entier. L’application aveugle, à long terme et excessive de substances récalcitrantes et toxiques, telles que les pesticides, les produits pétroliers, les plastiques et d’autres produits chimiques, a de graves effets sur l’écologie des sols et, par conséquent, peut altérer le microbiote des sols. Les communautés microbiennes dans les sols sont composées d’un large éventail d’organismes dans différents états physiologiques, la majorité étant des bactéries et des champignons. De nombreux contaminants dans les sols ont une stabilité à moyen et à long terme, et leur persistance peut conduire au développement de mécanismes adaptatifs qui permettent aux micro-organismes d’utiliser des substances récalcitrantes comme nutriments 2,3. Ces micro-organismes peuvent donc être pris en compte pour les techniques de bioremédiation.
La bioremédiation tente d’atténuer les effets de la pollution en utilisant des micro-organismes et leurs enzymes pour la dégradation ou la transformation des déchets en composés moins toxiques ou non toxiques. Diverses espèces d’archées, de bactéries, d’algues et de champignons possèdent cette capacité de bioremédiation4. En raison de leurs actions biodégradables particulières, les champignons sont des organismes particulièrement prometteurs pour la bioremédiation. Ils peuvent attaquer différents substrats en utilisant leur réseau hyphalique, ce qui leur permet de pénétrer dans la matrice du sol plus efficacement que les autres micro-organismes. De plus, ils peuvent atteindre des interstices inaccessibles où les contaminants sont difficiles à éliminer5, et ils peuvent également survivre à de faibles niveaux d’humidité6. De plus, les champignons synthétisent différentes cassettes d’enzymes non spécifiques, généralement pour dégrader les substances récalcitrantes naturelles telles que la cellulose, la lignine et les acides humiques. Ceux qui n’ont pas le substrat cible peuvent être impliqués dans la dégradation d’un large éventail de polluants récalcitrants, tels que les hydrocarbures, les plastiques et les pesticides 7,8,9,10. Par conséquent, bien que de nombreuses espèces fongiques aient déjà été signalées comme agents de bioremédiation, il y a un intérêt croissant pour l’exploration d’espèces qui n’ont pas encore été étudiées afin de sélectionner des candidats pour la bioremédiation de substances contaminantes récalcitrantes. Les espèces déjà connues pour avoir des propriétés de bioremédiation appartiennent au phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 et Mucoromycota. Par exemple, les genres Penicillium et Aspergillus sont bien connus pour être impliqués dans la dégradation des hydrocarbures aliphatiques13, des différents polymères plastiques 16,17,18, des métaux lourds 19 et des colorants20. De même, des études menées sur les champignons basidiomycètes, tels que Phanerochaete chrysosporium et Trametes versicolor, ont révélé leur implication dans l’oxydation de matériaux récalcitrants tels que les hydrocarbures aromatiques13 et les plastiques21. Un autre exemple de champignons impliqués dans les processus de biodégradation sont les zygomycètes Rhizopus spp., Mucor spp. et Cunninghamella spp.22,23. En particulier, Cunninghamella est capable d’oxyder les hydrocarbures aromatiques et est considéré comme un organisme modèle pour l’étude de la désintoxication des produits d’une large gamme de xénobiotiques13.
Il existe plusieurs enzymes fongiques impliquées dans les principaux processus de dégradation des matériaux récalcitrants24,25, tels que l’estérase, la laccase, la peroxydase et la protéase. Les laccases sont des oxydases contenant du cuivre produites dans la cellule et sécrétées par la suite, qui permettent l’oxydation d’une variété de composés phénoliques et aromatiques. Ils peuvent dégrader les ortho et para diphénols, les phénols contenant le groupe aminé, la lignine et les diamines contenant le groupe aryle26. Les peroxydases utilisent le peroxyde d’hydrogène comme médiateur pour dégrader la lignine et d’autres composés aromatiques. Il existe de nombreuses peroxydases différentes, mais celles qui ont le plus grand potentiel de dégrader les substances toxiques sont la lignine peroxydase et la peroxydase de manganèse27.
Les estérases et les protéases appartiennent au groupe des enzymes extra- ou ecto-cellulaires, qui agissent en dehors de leurs cellules d’origine mais y sont toujours liées. Ces enzymes peuvent catalyser l’hydrolyse de grosses molécules récalcitrantes en molécules plus petites. En raison de leur faible spécificité de substrat, ces enzymes peuvent jouer un rôle clé dans la bioremédiation de divers polluants, tels que les colorants textiles, les effluents libérés par les industries des pâtes et papiers et le tannage du cuir, les produits pétroliers, les plastiques et les pesticides 28,29,30.
Un certain nombre de méthodes de dépistage pour sélectionner les souches fongiques biorémédiatrices ont déjà été publiées. Par exemple, un milieu d’agar à base de paille a été utilisé pour dépister les champignons de pourriture blanche à fort potentiel dans la dégradation des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)31; et de petits morceaux de bois en décomposition ont été placés sur de la gélose à l’extrait de malt (MEA) pour isoler les champignons pourrissantsdu bois 32. Cependant, la plupart des méthodes qui ont déjà été proposées sélectionnent des champignons très spécifiques pour leur activité d’intérêt. Cette recherche propose une approche plus large pour sélectionner les champignons du sol avec un plus large éventail d’actions. La méthode repose sur le placage initial de dilutions en série d’échantillons de sol sur un milieu modifié avec des acides humiques ou de la lignocellulose mélangée à des antibiotiques pour sélectionner des champignons capables de dégrader ces substances récalcitrantes naturelles. Les acides humiques et la lignocellulose, en fait, sont des substances extrêmement résistantes à la biodégradation car elles ont des structures moléculaires très complexes, ce qui leur permet d’être d’excellents indicateurs de la capacité de dégradation des champignons testés33,34. Par la suite, les champignons sélectionnés lors des premiers essais sont passés au crible pour identifier ceux qui ont le potentiel de dégrader des polluants spécifiques tels que la vaseline, l’huile moteur usagée et les plastiques. Enfin, des tests enzymatiques qualitatifs sont effectués pour détecter les souches fongiques capables de produire des enzymes impliquées dans les processus de biodégradation des substances récalcitrantes. À cette fin, des tests de protéase et d’estérase sont effectués, tandis que l’acide gallique et le guaiacol sont utilisés comme indicateurs de la production de laccase et d’autres enzymes ligninolytiques35,36. Ces substrats sont utilisés parce qu’une forte corrélation a été trouvée entre la capacité des champignons à les oxyder à leur forme de couleur brune et la possession de la capacité ligninolytique 37,38,39.
Grâce à ces protocoles, il est possible d’isoler des souches fongiques à fort potentiel de dégradation et à large spectre d’action directement à partir d’échantillons de sol. L’isolement de ces souches fongiques pourrait aider à trouver de nouveaux candidats à des fins de bioremédiation.
Protocol
Representative Results
Discussion
La riche biodiversité des sols est une source abondante de champignons qui possèdent de nombreuses capacités métaboliques, dont certaines pourraient être des candidats potentiels pour la bioremédiation. Les tests sélectifs des milieux (section 1 du protocole) sont des méthodes faciles à réaliser et efficaces pour isoler les champignons capables de se développer sur des polymères complexes naturels comme seule source de carbone. Les champignons peuvent produire des hydrolases extracellulaires non spécifiques …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) de l’Université de Pavie et le professeur Solveig Tosi pour avoir fourni l’opportunité de ce travail.
Materials
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
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