Isolering og screening fra jordens biodiversitet for svampe involveret i nedbrydning af genstridige materialer
Summary
Her præsenterer vi en protokol til screening af jordens biodiversitet for at lede efter svampestammer, der er involveret i nedbrydning af genstridige materialer. For det første isoleres svampestammer, der er i stand til at vokse på huminsyrer eller lignocellulose. Deres aktivitet testes derefter både i enzymatiske assays og på forurenende stoffer som kulbrinter og plast.
Abstract
Miljøforurening er et stigende problem, og det er en væsentlig opgave at identificere svampe, der er involveret i bioremedieringsprocessen. Jord er vært for en utrolig mangfoldighed af mikrobielt liv og kan være en god kilde til disse bioremedierende svampe. Dette arbejde har til formål at søge efter jordsvampe med bioremedieringspotentiale ved hjælp af forskellige screeningstests. Mineralske dyrkningsmedier suppleret med genstridige stoffer som den eneste kulstofkilde blev anvendt som væksttest. For det første blev jordfortyndinger belagt på petriskåle med mineralsk medium ændret med humic syrer eller lignocellulose. De voksende svampekolonier blev isoleret og testet på forskellige substrater, såsom komplekse blandinger af carbonhydrider (petrolatum og brugt motorolie) og pulvere af forskellige plastpolymerer (PET, PP, PS, PUR, PVC). Kvalitative enzymatiske tests var forbundet med væksttestene for at undersøge produktionen af esteraser, laccases, peroxidaser og proteaser. Disse enzymer er involveret i de vigtigste nedbrydningsprocesser af genstridigt materiale, og deres konstitutive sekretion af de undersøgte svampestammer kan have potentiale til at blive udnyttet til bioremediering. Mere end 100 stammer blev isoleret og testet, og der blev fundet flere isolater med et godt bioremedieringspotentiale. Afslutningsvis er de beskrevne screeningstests en nem og billig metode til at identificere svampestammer med bioremedieringspotentiale fra jorden. Derudover er det muligt at skræddersy screeningstestene for forskellige forurenende stoffer i henhold til kravene ved at tilføje andre genstridige stoffer til minimale kulturmedier.
Introduction
Jord er en grundlæggende bestanddel af livet på Jorden og er grundlaget for mange økosystemer. Mineraler, organisk materiale og mikroorganismer i jorden kan betragtes som et system, med tætte foreninger og interaktioner mellem dem. Samspillet mellem disse forbindelser har en vigtig indvirkning på terrestriske processer, miljøkvalitet og økosystemets sundhed1. Jordforurening udgør alvorlige miljøproblemer på verdensplan. Den vilkårlige, langsigtede og overdrevne anvendelse af genstridige og giftige stoffer, såsom pesticider, olieprodukter, plast og andre kemikalier, har alvorlige virkninger på jordens økologi og kan som følge heraf ændre jordens mikrobiota. Mikrobielle samfund i jordbunden består af en bred vifte af organismer i forskellige fysiologiske tilstande, hvor størstedelen er bakterier og svampe. Mange af de forurenende stoffer i jordbunden har stabilitet på mellemlang til lang sigt, og deres vedholdenhed kan føre til udvikling af adaptive mekanismer, der gør det muligt for mikroorganismerne at udnytte genstridige stoffer som næringsstoffer 2,3. Disse mikroorganismer kan derfor overvejes til bioremedieringsteknikker.
Bioremediering forsøger at afbøde virkningerne af forurening ved at anvende mikroorganismer og deres enzymer til nedbrydning eller omdannelse af affald til mindre giftige eller ikke-toksiske forbindelser. Forskellige arter af arkæer, bakterier, alger og svampe besidder denne bioremedieringsevne4. Som et resultat af deres særlige bionedbrydelige virkninger er svampe særligt lovende organismer til bioremediering. De kan angribe forskellige substrater ved hjælp af deres bindestregsnetværk, så de kan trænge ind i jordmatrixen mere effektivt end andre mikroorganismer. Derudover kan de nå utilgængelige mellemrum, hvor forurenende stoffer er vanskelige at fjerne5, og de kan også overleve lave fugtighedsniveauer6. Desuden syntetiserer svampe forskellige kassetter af uspecifikke enzymer, normalt for at nedbryde naturlige genstridige stoffer som cellulose, lignin og huminsyrer. De, der mangler målsubstratet, kan være involveret i nedbrydningen af en lang række genstridige forurenende stoffer, såsom kulbrinter, plast og pesticider 7,8,9,10. Selv om mange svampearter allerede er blevet rapporteret som bioremedieringsmidler, er der derfor stigende interesse for at udforske arter, der endnu ikke er blevet undersøgt for at udvælge kandidater til bioremediering af genstridige forurenende stoffer. De arter, der allerede vides at have bioremedieringsegenskaber, tilhører phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 og Mucoromycota. For eksempel er slægterne Penicillium og Aspergillus velkendte for at være involveret i nedbrydningen af alifatiske carbonhydrider13, forskellige plastpolymerer 16,17,18, tungmetaller 19 og farvestoffer20. Tilsvarende har undersøgelser udført på basidiomycetes svampe, såsom Phanerochaete chrysosporium og Trametes versicolor, afsløret deres involvering i oxidationen af genstridige materialer såsom aromatiske carbonhydrider13 og plast21. Et andet eksempel på svampe involveret i bionedbrydningsprocesserne er zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., og Cunninghamella spp.22,23. Cunninghamella er især i stand til at oxidere aromatiske kulbrinter og betragtes som en modelorganisme til undersøgelse af afgiftning af produkter fra en bred vifte af xenobiotika13.
Der er flere svampeenzymer involveret i de store nedbrydende processer af genstridige materialer24,25, såsom esterase, laccase, peroxidase og protease. Laccases er kobberholdige oxidaser produceret i cellen og efterfølgende udskilt, der tillader oxidation af en række phenoliske og aromatiske forbindelser. De kan nedbryde ortho- og paradiphenoler, de aminogruppeholdige phenoler, lignin og de arylgruppeholdige diaminer26. Peroxidaser bruger hydrogenperoxid som mediator til at nedbryde lignin og andre aromatiske forbindelser. Der er mange forskellige peroxidaser, men dem med det største potentiale til at nedbryde giftige stoffer er ligninperoxidase og manganperoxidase27.
Esteraser og proteaser tilhører gruppen af ekstra- eller ektocellulære enzymer, som virker uden for deres oprindelsesceller, men stadig er bundet til dem. Disse enzymer kan katalysere hydrolysen af store genstridige molekyler i mindre. På grund af deres lave substratspecicitet kan disse enzymer spille en nøglerolle i bioremediering af forskellige forurenende stoffer, såsom tekstilfarvestoffer, spildevand frigivet fra papirmasse- og papirindustrien og lædergarvning, olieprodukter, plast og pesticider 28,29,30.
En række screeningsmetoder til udvælgelse for bioremedierende svampestammer er allerede blevet offentliggjort. For eksempel er halmbaseret agarmedium blevet brugt til at screene for hvidrotsvampe med stort potentiale i nedbrydningen af de polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH)31; og små stykker rådnende træ er blevet anbragt på maltekstraktagar (MEA) for at isolere trærådnende svampe32. Imidlertid vælger de fleste af de metoder, der allerede er blevet foreslået, meget specifikke svampe til deres aktivitet af interesse. Denne forskning foreslår en bredere tilgang til udvælgelse af jordsvampe med en bredere vifte af handlinger. Metoden er afhængig af den indledende plettering af serielle fortyndinger af jordprøver på et medium ændret med huminsyrer eller lignocellulose blandet med antibiotika for at udvælge svampe med evnen til at nedbryde disse naturlige genstridige stoffer. Huminsyrer og lignocellulose er faktisk stoffer, der er ekstremt resistente over for bionedbrydning, da de har meget komplekse molekylære strukturer, og dette gør det muligt for dem at være fremragende indikatorer for de testede svampes nedbrydende evne33,34. Derefter screenes de svampe, der blev udvalgt i de første tests, for at identificere dem, der har potentiale til at nedbryde specifikke forurenende stoffer såsom petrolatum, brugt motorolie og plast. Endelig udføres kvalitative enzymatiske tests for at detektere svampestammer, der er i stand til at producere enzymer involveret i bionedbrydningsprocesserne af genstridige stoffer. Til dette formål udføres protease- og esterasetest, mens gallinsyre og guaiacol anvendes som indikatorer for laccase og anden ligninolytisk enzymproduktion35,36. Disse substrater anvendes, fordi der er fundet en stærk sammenhæng mellem svampenes evne til at oxidere dem til deres brunfarvede form og besiddelsen af ligninolytisk evne 37,38,39.
Gennem disse protokoller er det muligt at isolere svampestammer med højt nedbrydende potentiale og et bredt spektrum af handlinger direkte fra jordprøver. Isoleringen af disse svampestammer kan hjælpe med at finde nye kandidater til bioremedieringsformål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jordens rige biodiversitet er en rigelig kilde til svampe, der besidder mange metaboliske evner, hvoraf nogle kan være potentielle kandidater til bioremediering. Selektive medietest (afsnit 1 i protokollen) er nemme at udføre og effektive metoder til isolering af svampe, der er i stand til at vokse på naturlige komplekse polymerer som deres eneste kulstofkilde. Svampe kan producere ekstracellulære, ikke-specifikke hydrolaser og oxidoreduktaser30 , såsom de ligninolytiske enzymer laccases og p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) fra University of Pavia og professor Solveig Tosi for at give mulighed for dette arbejde.
Materials
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
- Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
- Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation – A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
- Dix, N. J., Webster, J. . Fungal Ecology. , (1995).
- Magan, N., Esser, K., Lemke, P. A. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. 4, 99-114 (2007).
- Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
- Hasan, I. F., AI-Jawhari, V., Kumar, M., Kumar, R., Prasad, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. , (2018).
- Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
- Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
- Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
- Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
- Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 1-36 (2018).
- Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig’s Corrosion Handbook. , 421-438 (2011).
- Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, 224-239 (2019).
- DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
- El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
- Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
- Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
- Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
- Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
- Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
- Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
- Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , (2019).
- Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
- Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , (2019).
- Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
- Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
- Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
- Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
- Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
- Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
- Stevenson, F. J. . Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , (1995).
- Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
- Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
- Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
- Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
- Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
- Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
- Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
- Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
- Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
- Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
- Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).
