בידוד וסינון מהמגוון הביולוגי בקרקע עבור פטריות המעורבות בהתדרדרות של חומרים סרבנים
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת המגוון הביולוגי בקרקע כדי לחפש זנים פטרייתיים המעורבים בפירוק של חומרים סרבנים. ראשית, זנים פטרייתיים המסוגלים לגדול על חומצות הומיות או ליגנוצלולוז מבודדים. פעילותם נבדקת לאחר מכן הן במבחנים אנזימטיים והן במזהמים כגון פחמימנים ופלסטיק.
Abstract
זיהום סביבתי הוא בעיה הולכת וגוברת, וזיהוי פטריות המעורבות בתהליך הביו-רמדיה הוא משימה חיונית. אדמה מארחת מגוון מדהים של חיים מיקרוביאליים ויכולה להיות מקור טוב לפטריות ביולוגיות אלה. עבודה זו נועדה לחפש פטריות אדמה עם פוטנציאל שיקום ביולוגי באמצעות בדיקות סינון שונות. מדיית תרביות מינרלים בתוספת חומרים סרבנים כמקור הפחמן היחיד שימשה כמבחני גדילה. ראשית, דילול הקרקע צופה על צלחות פטרי עם מדיום מינרלי מתוקן עם חומצות הומיות או lignocellulose. המושבות הפטרייתיות הגדלות בודדו ונבדקו על מצעים שונים, כגון תערובות מורכבות של פחמימנים (פטרולאטום ושמן מנוע משומש) ואבקות של פולימרים פלסטיים שונים (PET, PP, PS, PUR, PVC). בדיקות אנזימטיות איכותיות נקשרו לבדיקות הגדילה כדי לחקור את הייצור של אסטרזות, לקאזות, פרוקסידאזות ופרוטאזות. אנזימים אלה מעורבים בתהליכי הפירוק העיקריים של חומר סרבני, וההפרשה המכוננת שלהם על ידי הזנים הפטרייתיים שנבדקו עשויה להיות בעלת פוטנציאל להיות מנוצל לצורך רה-שיקום ביולוגי. יותר מ-100 זנים בודדו ונבדקו, ונמצאו כמה מבודדים עם פוטנציאל שיקום ביולוגי טוב. לסיכום, בדיקות הסינון המתוארות הן שיטה קלה ובעלות נמוכה לזיהוי זנים פטרייתיים עם פוטנציאל לשיקום ביולוגי מהקרקע. בנוסף, ניתן להתאים את בדיקות הסינון למזהמים שונים, על פי הדרישות, על ידי הוספת חומרים סרבניים אחרים למדיה תרבותית מינימלית.
Introduction
אדמה היא מרכיב בסיסי בחיים על פני כדור הארץ והיא הבסיס למערכות אקולוגיות רבות. המינרלים, החומר האורגני והמיקרואורגניזמים בקרקע יכולים להיחשב כמערכת אחת, עם קשרים הדוקים ואינטראקציות המתרחשות ביניהם. לאינטראקציות של תרכובות אלה יש השפעה חשובה על תהליכים יבשתיים, איכות הסביבה ובריאות המערכת האקולוגית1. זיהום קרקע מציב בעיות סביבתיות חמורות ברחבי העולם. ליישום חסר ההבחנה, ארוך הטווח והמופרז של חומרים סרבנים ורעילים, כגון חומרי הדברה, מוצרי נפט, פלסטיק וכימיקלים אחרים, יש השפעות חמורות על האקולוגיה של הקרקע, וכתוצאה מכך, הוא יכול לשנות את המיקרוביוטה של הקרקע. קהילות מיקרוביאליות בקרקעות מורכבות ממגוון רחב של אורגניזמים במצבים פיזיולוגיים שונים, כאשר רובם הם חיידקים ופטריות. לרבים מהמזהמים בקרקעות יש יציבות לטווח בינוני עד ארוך, וההתמדה שלהם עלולה להוביל לפיתוח מנגנוני הסתגלות המאפשרים למיקרואורגניזמים להשתמש בחומרים סרבנים כחומרים מזינים 2,3. מיקרואורגניזמים אלה יכולים, אם כן, להיחשב עבור טכניקות bioremediation.
Bioremediation מנסה למתן את ההשפעות של זיהום על ידי שימוש במיקרואורגניזמים ובאנזימים שלהם לפירוק או טרנספורמציה של פסולת לתרכובות פחות רעילות או לא רעילות. מינים שונים של ארכיאה, חיידקים, אצות ופטריות הם בעלי יכולת התחדשות ביולוגית זו4. כתוצאה מהפעולות המתכלות המסוימות שלהם, פטריות הן אורגניזמים מבטיחים במיוחד עבור bioremediation. הם יכולים לתקוף מצעים שונים באמצעות רשת ההיפל שלהם, מה שמאפשר להם לחדור למטריצת הקרקע בצורה יעילה יותר מאשר מיקרואורגניזמים אחרים. בנוסף, הם יכולים להגיע לאינטרסטים בלתי נגישים שבהם קשה להסיר מזהמים5, והם יכולים גם לשרוד רמות לחות נמוכות6. יתר על כן, פטריות מסנתזות קלטות שונות של אנזימים לא ספציפיים, בדרך כלל כדי לפרק חומרים סרבנים טבעיים כגון תאית, ליגנין וחומצות הומיות. אלה שאין להם את מצע המטרה יכולים להיות מעורבים בפירוק של מגוון רחב של מזהמים סרבנים, כגון פחמימנים, פלסטיק וחומרי הדברה 7,8,9,10. לכן, למרות שמינים פטרייתיים רבים כבר דווחו כסוכנים ביולוגיים, יש עניין גובר לחקור מינים שעדיין לא נחקרו כדי לבחור מועמדים לתיקון ביולוגי של חומרים מזהמים סרבניים. המינים שכבר ידועים כבעלי תכונות ביולוגיות שייכים לפילה אסקומיקוטה 11,12,13, באסידיומיקוטה14,15 ומוקורומיקוטה. לדוגמה, הסוגים פניציליום ואספרגילוס ידועים כמעורבים בפירוק של פחמימנים אליפטיים13, פולימרים פלסטיים שונים 16,17,18, מתכות כבדות19 וצבעים20. באופן דומה, מחקרים שבוצעו על פטריות basidiomycetes, כגון Phanerochaete chrysosporium ו– Trametes versicolor, חשפו את מעורבותם בחמצון של חומרים סרבנים כגון פחמימנים ארומטיים13 ופלסטיק21. דוגמה נוספת לפטריות המעורבות בתהליכי ההתכלות הביולוגית הן הזיגומיסטים Rhizopus spp., Mucor spp., ו– Cunninghamella spp.22,23. בפרט, קנינגהם מסוגלת לאקסידאז פחמימנים ארומטיים ונחשבת לאורגניזם מודל לחקר ניקוי רעלים של מוצרים ממגוון רחב של קסנוביוטיקה13.
ישנם מספר אנזימים פטרייתיים המעורבים בתהליכים המשפילים העיקריים של חומרים סרבנים24,25, כגון אסטראז, לקאז, פרוקסידאז ופרוטאז. לקאזות הן אוקסידאזות המכילות נחושת המיוצרות בתא ומופרשות לאחר מכן, המאפשרות חמצון של מגוון תרכובות פנוליות וארומטיות. הם יכולים לפרק אורתו ופרה-דיפנולים, את הפנולים המכילים את קבוצת האמינו, את הליגנין ואת הדיאמינים המכילים את קבוצת האריל26. פרוקסידאזות משתמשות במי חמצן כמתווך כדי לפרק את הליגנין ותרכובות ארומטיות אחרות. ישנם פרוקסידאזות רבות ושונות, אך אלה עם הפוטנציאל הגדול ביותר לפרק חומרים רעילים הם ליגנין פרוקסידאז ומנגן פרוקסידאז27.
אסטרזות ופרוטאזות שייכות לקבוצת האנזימים החוץ-תאיים או האקטו-תאיים, הפועלים מחוץ לתאי המוצא שלהם אך עדיין קשורים אליהם. אנזימים אלה יכולים לזרז את ההידרוליזה של מולקולות סרבניות גדולות למולקולות קטנות יותר. בשל הספציפיות הנמוכה שלהם לסובסטרט, אנזימים אלה יכולים למלא תפקיד מפתח בחידוש ביולוגי של מזהמים שונים, כגון צבעי טקסטיל, שפכים המשתחררים מתעשיות העיסה והנייר ושיזוף עור, מוצרי נפט, פלסטיק וחומרי הדברה 28,29,30.
מספר שיטות סינון לבחירה עבור זנים פטרייתיים ביו-רמדיקטיביים כבר פורסמו. לדוגמה, מדיום אגר מבוסס קש שימש לסינון פטריות ריקבון לבן עם פוטנציאל גבוה בהתפרקות הפחמימנים הארומטיים הפוליציקליים (PAH)31; ופיסות קטנות של עץ נרקב הונחו על אגר תמצית מאלט (MEA) כדי לבודד פטריות נרקבות עץ32. עם זאת, רוב השיטות שכבר הוצעו בוחרות פטריות ספציפיות מאוד לפעילות העניין שלהן. מחקר זה מציע גישה רחבה יותר לבחירת פטריות אדמה עם טווח פעולה רחב יותר. השיטה מסתמכת על ציפוי ראשוני של דילולים סדרתיים של דגימות קרקע על מדיום מתוקן עם חומצות הומיות או lignocellulose מעורבב עם אנטיביוטיקה כדי לבחור פטריות עם היכולת לפרק את החומרים הסרבניים הטבעיים האלה. חומצות הומיות וליגנוצלולוז, למעשה, הן חומרים עמידים מאוד להתכלות ביולוגית מכיוון שיש להם מבנים מולקולריים מורכבים מאוד, וזה מאפשר להם להיות אינדיקטורים מצוינים ליכולת המשפילה של הפטריות שנבדקו33,34. לאחר מכן, הפטריות שנבחרו בבדיקות הראשונות נבדקות כדי לזהות את אלה שיש להן פוטנציאל לפגוע במזהמים ספציפיים כמו פטרולאטום, שמן מנוע משומש ופלסטיק. לבסוף, בדיקות אנזימטיות איכותיות מבוצעות כדי לזהות זנים פטרייתיים המסוגלים לייצר אנזימים המעורבים בתהליכי הפירוק הביולוגי של חומרים סרבנים. לשם כך נערכות בדיקות פרוטאז ואסטראז, בעוד שחומצה גאלית וגואיקול משמשות כאינדיקטורים ללקאז ולייצור אנזים לינינוליטי אחר35,36. מצעים אלה משמשים משום שנמצא מתאם חזק בין יכולתן של פטריות לחמצן אותן לצורתן החומה לבין החזקת היכולת הלינינוליטית 37,38,39.
באמצעות פרוטוקולים אלה, ניתן לבודד זנים פטרייתיים בעלי פוטנציאל מתכלה גבוה וקשת רחבה של פעולה ישירות מדגימות קרקע. הבידוד של הזנים הפטרייתיים האלה יכול לעזור למצוא מועמדים חדשים למטרות של רה-מדיה ביולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
המגוון הביולוגי העשיר של האדמה הוא מקור שופע של פטריות בעלות יכולות מטבוליות רבות, שחלקן עשויות להיות מועמדות פוטנציאליות לשיקום ביולוגי. בדיקות מדיה סלקטיביות (סעיף 1 של הפרוטוקול) הן שיטות קלות לביצוע ויעילות לבידוד פטריות המסוגלות לגדול על פולימרים מורכבים טבעיים כמקור הפחמן היחיד של?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לסקואולה די אלטה פורמציונה דוטוראלה (SAFD) מאוניברסיטת פאביה ולפרופסור סולביג טוסי על מתן ההזדמנות לעבודה זו.
Materials
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
- Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
- Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation – A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
- Dix, N. J., Webster, J. . Fungal Ecology. , (1995).
- Magan, N., Esser, K., Lemke, P. A. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. 4, 99-114 (2007).
- Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
- Hasan, I. F., AI-Jawhari, V., Kumar, M., Kumar, R., Prasad, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. , (2018).
- Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
- Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
- Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
- Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
- Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 1-36 (2018).
- Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig’s Corrosion Handbook. , 421-438 (2011).
- Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, 224-239 (2019).
- DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
- El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
- Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
- Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
- Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
- Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
- Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
- Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
- Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , (2019).
- Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
- Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , (2019).
- Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
- Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
- Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
- Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
- Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
- Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
- Stevenson, F. J. . Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , (1995).
- Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
- Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
- Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
- Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
- Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
- Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
- Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
- Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
- Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
- Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
- Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).
