Isolasjon og screening fra jordmangfold for sopp involvert i nedbrytning av tilbakevendende materialer

Summary

Her presenterer vi en protokoll for screening av jordmangfold for å se etter soppstammer involvert i nedbrytning av tilbakevendende materialer. For det første er soppstammer i stand til å vokse på humsyrer eller lignocellulose isolert. Deres aktivitet testes deretter både i enzymatiske analyser og på miljøgifter som hydrokarboner og plast.

Abstract

Miljøforurensning er et økende problem, og det er en viktig oppgave å identifisere sopp involvert i bioremedieringsprosessen. Jord er vert for et utrolig mangfold av mikrobielt liv og kan være en god kilde til disse bioremediative soppene. Dette arbeidet tar sikte på å søke etter jordsvamp med bioremedieringspotensial ved å bruke forskjellige screeningtester. Mineralkulturmedier supplert med tilbakevendende stoffer da den eneste karbonkilden ble brukt som veksttester. For det første ble jordfortynning belagt på Petri-retter med mineralmedium endret med humsyrer eller lignocellulose. De voksende soppkoloniene ble isolert og testet på forskjellige substrater, for eksempel komplekse blandinger av hydrokarboner (petrolatum og brukt motorolje) og pulver av forskjellige plastpolymerer (PET, PP, PS, PUR, PVC). Kvalitative enzymatiske tester var forbundet med veksttestene for å undersøke produksjon av esteraser, lakcaser, peroksidaser og proteaser. Disse enzymene er involvert i de viktigste nedbrytningsprosessene for tilbakevendende materiale, og deres konstituerende sekresjon av de undersøkte soppstammene kan ha potensial til å bli utnyttet for bioremediering. Mer enn 100 stammer ble isolert og testet, og flere isolerer med godt bioremedieringspotensial ble funnet. Til slutt er de beskrevne screeningtestene en enkel og rimelig metode for å identifisere soppstammer med bioremedieringspotensial fra jorda. I tillegg er det mulig å skreddersy screeningtestene for ulike miljøgifter, i henhold til kravene, ved å legge til andre tilbakevendende stoffer i minimale kulturmedier.

Introduction

Jord er en grunnleggende del av livet på jorden og er grunnlaget for mange økosystemer. Mineraler, organisk materiale og mikroorganismer i jorda kan betraktes som ett system, med nære assosiasjoner og interaksjoner mellom dem. Samspillet mellom disse forbindelsene har en viktig innvirkning på terrestriske prosesser, miljøkvalitet og økosystemhelse¹. Jordforurensning utgjør alvorlige miljøproblemer over hele verden. Den ukritiske, langsiktige og overdreven anvendelsen av tilbakevendende og giftige stoffer, som plantevernmidler, petroleumsprodukter, plast og andre kjemikalier, har alvorlige effekter på jordøkologi og kan som et resultat endre jordmikrobiota. Mikrobielle samfunn i jord består av et bredt spekter av organismer i forskjellige fysiologiske tilstander, der de fleste er bakterier og sopp. Mange av forurensningene i jord har middels til langsiktig stabilitet, og deres utholdenhet kan føre til utvikling av adaptive mekanismer som gjør at mikroorganismer kan utnytte tilbakevendende stoffer som næringsstoffer ^2,3. Disse mikroorganismer kan derfor vurderes for bioremedieringsteknikker.

Bioremediering forsøker å redusere effekten av forurensning ved å bruke mikroorganismer og deres enzymer for nedbrytning eller transformasjon av avfall til mindre giftige eller ikke-giftige forbindelser. Ulike arter av arkaea, bakterier, alger og sopp har denne bioremedieringsevnen⁴. Som et resultat av deres spesielle biologisk nedbrytende handlinger er sopp spesielt lovende organismer for bioremediering. De kan angripe forskjellige substrater ved hjelp av hyphalnettverket, slik at de kan trenge inn i jordmatrisen mer effektivt enn andre mikroorganismer. I tillegg kan de nå utilgjengelige interstices der forurensninger er vanskelige å fjerne⁵, og de kan også overleve lave fuktighetsnivåer⁶. Videre syntetiserer sopp forskjellige kassetter av uspesifiserte enzymer, vanligvis for å forringe naturlige tilbakevendende stoffer som cellulose, lignin og humsyrer. De som mangler målsubstratet kan være involvert i nedbrytning av et bredt spekter av tilbakevendende miljøgifter, som hydrokarboner, plast og plantevernmidler ^7,8,9,10. Derfor, selv om mange sopparter allerede er rapportert som bioremedieringsmidler, er det økende interesse for å utforske arter som ennå ikke er studert for å velge kandidater til bioremediering av tilbakevendende forurensende stoffer. Arten som allerede er kjent for å ha bioremedieringsegenskaper tilhører phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota ^14,15 og Mucoromycota. For eksempel er slekten Penicillium og Aspergillus kjent for å være involvert i nedbrytning av alifatiske hydrokarboner¹³, forskjellige plastpolymerer^16,17,18, tungmetaller¹⁹ og fargestoffer²⁰. På samme måte har studier utført på basidiomycetes sopp, som Phanerochaete chrysosporium og Trametes versicolor, avslørt deres engasjement i oksidasjon av tilbakevendende materialer som aromatiske hydrokarboner¹³ og plast²¹. Et annet eksempel på sopp involvert i biologisk nedbrytningsprosessene er zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., og Cunninghamella spp.22,23. Spesielt er Cunninghamella i stand til å oksidase aromatiske hydrokarboner og regnes som en modellorganisme for å studere avgiftning av produkter fra et bredt spekter av xenobiotika¹³.

Det er flere soppenzymer involvert i de store nedbrytende prosessene for tilbakevendende materialer ^24,25, som esterase, lakcase, peroksidase og protease. Laccases er kobberholdige oksidaser produsert i cellen og deretter utskilt, noe som tillater oksidasjon av en rekke fenoliske og aromatiske forbindelser. De kan forringe ortho og para diphenoler, aminogruppeholdige fenoler, lignin og arylgruppen som inneholder diaminer²⁶. Peroksididaser bruker hydrogenperoksid som megler for å forringe lignin og andre aromatiske forbindelser. Det er mange forskjellige peroksidaser, men de med størst potensial til å forringe giftige stoffer er lignin peroksidase og mangan peroksidase²⁷.

Esteraser og proteaser tilhører gruppen av ekstra- eller ekto-cellulære enzymer, som virker utenfor opprinnelsescellene, men som fortsatt er bundet til dem. Disse enzymene kan katalysere hydrolysen av store tilbakevendende molekyler i mindre. På grunn av deres lave substratspesifisitet kan disse enzymene spille en nøkkelrolle i bioremediering av ulike miljøgifter, for eksempel tekstilfarger, avløpsstoffer frigjort fra masse- og papirindustrien og lærbruning, petroleumsprodukter, plast og plantevernmidler 28,29,30.

En rekke screeningmetoder for å velge for bioremediative soppstammer er allerede publisert. For eksempel har halmbasert agarmedium blitt brukt til å screene for hvitrotsvamp med høyt potensial i polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH) nedbrytning³¹; og små biter av råtnende tre har blitt plassert på malt ekstrakt agar (MEA) for å isolere trerotting sopp³². Imidlertid velger de fleste metodene som allerede er foreslått, svært spesifikke sopp for deres interesseaktivitet. Denne forskningen foreslår en bredere tilnærming for å velge jordsvamp med et bredere spekter av handling. Metoden er avhengig av den første plating av serielle fortynninger av jordprøver på et medium endret med humsyrer eller lignocellulose blandet med antibiotika for å velge sopp med evnen til å forringe disse naturlige tilbakevendende stoffene. Humsyrer og lignocellulose er faktisk stoffer som er ekstremt motstandsdyktige mot biologisk nedbrytning siden de har svært komplekse molekylære strukturer, og dette gjør at de kan være gode indikatorer på de nedbrytende evnene til de testede soppene^33,34. Deretter screenes soppene som er valgt i de første testene for å identifisere de med potensial til å forringe spesifikke miljøgifter som petrolatum, brukt motorolje og plast. Til slutt utføres kvalitative enzymatiske tester for å oppdage soppstammer som er i stand til å produsere enzymer involvert i biologisk nedbrytningsprosesser av tilbakevendende stoffer. Til dette formål utføres protease- og esterasetester, mens gallsyre og guaiacol brukes som indikatorer på lakk og annen ligninolytisk enzymproduksjon^35,36. Disse substratene brukes fordi det er funnet en sterk sammenheng mellom soppens evne til å oksidere dem til deres brunfargede form og besittelse av ligninolytisk evne 37,38,39.

Gjennom disse protokollene er det mulig å isolere soppstammer med høyt nedbrytningspotensial og et bredt spekter av handling direkte fra jordprøver. Isolering av disse soppstammene kan bidra til å finne nye kandidater til bioremedieringsformål.

Protocol

1. Utvalg av soppstammer som er i stand til å forringe tilbakevendende materialer fra jord Forberedelse av antibiotikaoppløsning. Sett penicillin (50 mg/l), streptomycin (40 mg/l), klortetracyklin (40 mg/l), neomycin (100 mg/l) og kloramfenikol (100 mg/l) i 250 ml deionisert sterilt vann. Før du legger kloramfenikol til antibiotikaoppløsningen, oppløs den i 3 ml ≥99% etanol. Plasser antibiotikaløsningen på en magnetisk omrører (ingen varme) med en magneti…

Representative Results

De selektive mediemetodene (paragraf 1 i protokollen) gjorde det mulig å screene jordens rike biologiske mangfold og soppene med høyt bioremedieringspotensial som skulle velges. Med humsyre og lignocellulose media ble mer enn 100 soppstammer isolert. Disse soppene produserte enzymer involvert i biologisk nedbrytning av naturlige tilbakevendende materialer, som har en kjemisk struktur som ligner mange miljøgifter. Imidlertid trengte soppstammene isolert med de selektive mediene ytterligere screening. Spesielt isolerte …

Discussion

Det rike biologiske mangfoldet av jord er en rikelig kilde til sopp som har mange metabolske evner, hvorav noen kan være potensielle kandidater for bioremediering. Selektive medietester (paragraf 1 i protokollen) er enkle å utføre og effektive metoder for å isolere sopp som kan vokse på naturlige komplekse polymerer som sin eneste karbonkilde. Sopp kan produsere ekstracellulære, ikke-spesifikke hydrolaser og oksidoreductaser³⁰ som ligninolytiske enzymer lakcaser og peroksidaser<sup class="xr…

Materials

96 microwell plate	Greiner bio-one	650185
Agar	VWR	84609.05
Bushnell-Haas Broth	Fluka	B5051
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Chloroamphenicol	Eurobio	GABCRL006Z
Chlortetracycline	Sigma-Aldrich	Y0001451
CoCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
CuCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3279
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296
FeCl3·6H2O	Sigma-Aldrich	236489
Filter 0.2 µm	Whatman	10462200
gallic acid	Sigma-Aldrich	G7384
Glass cover slips	Biosigma	VBS634
Glass vials 15 mL	SciLabware	P35467
guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502
High-density polyethylene (HDPE)	Sigma-Aldrich	434272
Humic acids	Aldrich Chemistry	53680
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P8281
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Lignocellulose	/	/	Sterilized bioethanol production waste
L-shaped cell spreader	Laboindustria S.p.a	21133
magnetic stirrer	A.C.E.F	8235
Malt Extract Broth	Sigma-Aldrich	70146
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M2643
Micropipette 1000 μL	Gilson	FA10006M
Micropipette 200  μL	Gilson	FA10005M
MnCl2·4H2O	Sigma-Aldrich	M5005
Na2MoO4·2H2O	Sigma-Aldrich	M1651
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neomycin	Sigma-Aldrich	N0401000
Penicillin	Sigma-Aldrich	1504489
peptone	Sigma-Aldrich	83059
Polyethylene terephthalate (PET)	Goodfellow	ES306031
Petri dishes	Laboindustria S.p.a	21050
Petrolatum (Paraffin liquid)	A.C.E.F	009661
Potato Dextrose Broth	Sigma-Aldrich	P6685
Polystyrene (PS)	Sigma-Aldrich	331651
Polyurethane (PUR)	Sigma-Aldrich	GF20677923
Polyvinyl chloride (PVC)	Sigma-Aldrich	81388
Sterile falcon tube	Greiner bio-one	227 261
Sterile glass vials 20 mL	Sigma-Aldrich	SU860051
Sterile point 1000  μL	Gilson	F172511
Sterile point 200  μL	Gilson	F172311
Sterile polyethylene bags	WHIRL-PAK	B01018
sterile syringe	Rays	5523CM25
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S-6501
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754
Used engine oil	/	/	complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company
Vials 50 mL	Sigma-Aldrich	33108-U
ZnCl2	Sigma-Aldrich	Z0152