Isolering och screening från markens biologiska mångfald för svampar som är involverade i nedbrytningen av motsträviga material
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för screening av markens biologiska mångfald för att leta efter svampstammar som är involverade i nedbrytningen av motsträviga material. Först isoleras svampstammar som kan växa på humana syror eller lignocellulosa. Deras aktivitet testas sedan både i enzymatiska analyser och på föroreningar som kolväten och plast.
Abstract
Miljöföroreningar är ett ökande problem, och att identifiera svampar som är involverade i bioremedieringsprocessen är en viktig uppgift. Jord är värd för en otrolig mångfald av mikrobiellt liv och kan vara en bra källa till dessa bioremedierande svampar. Detta arbete syftar till att söka efter marksvampar med bioremedieringspotential genom att använda olika screeningtester. Mineralodlingsmedier kompletterade med motsträviga ämnen som enda kolkälla användes som tillväxttester. Först pläterades jordutspädningar på petriskålar med mineralmedium ändrat med humana syror eller lignocellulosa. De växande svampkolonierna isolerades och testades på olika substrat, såsom komplexa blandningar av kolväten (petrolatum och begagnad motorolja) och pulver av olika plastpolymerer (PET, PP, PS, PUR, PVC). Kvalitativa enzymatiska tester associerades med tillväxttesterna för att undersöka produktionen av esteraser, laccases, peroxidaser och proteaser. Dessa enzymer är involverade i de huvudsakliga nedbrytningsprocesserna av motsträvigt material, och deras konstitutiva utsöndring av de undersökta svampstammarna kan ha potential att utnyttjas för bioremediering. Mer än 100 stammar isolerades och testades, och flera isolat med god bioremedieringspotential hittades. Sammanfattningsvis är de beskrivna screeningtesterna en enkel och billig metod för att identifiera svampstammar med bioremedieringspotential från jorden. Dessutom är det möjligt att skräddarsy screeningtesterna för olika föroreningar, enligt kraven, genom att lägga till andra motsträviga ämnen till minimala odlingsmedier.
Introduction
Jord är en grundläggande del av livet på jorden och är grunden för många ekosystem. Mineralerna, organiskt material och mikroorganismer i jorden kan betraktas som ett system, med nära föreningar och interaktioner som uppstår mellan dem. Samspelet mellan dessa föreningar har en viktig inverkan på terrestra processer, miljökvalitet och ekosystemhälsa1. Markföroreningar utgör allvarliga miljöproblem över hela världen. Den urskillningslösa, långsiktiga och överdrivna tillämpningen av motsträviga och giftiga ämnen, såsom bekämpningsmedel, petroleumprodukter, plast och andra kemikalier, har allvarliga effekter på markens ekologi och kan som ett resultat förändra markens mikrobiota. Mikrobiella samhällen i jordar består av ett brett spektrum av organismer i olika fysiologiska tillstånd, där majoriteten är bakterier och svampar. Många av föroreningarna i jord har stabilitet på medellång till lång sikt, och deras uthållighet kan leda till utveckling av adaptiva mekanismer som gör det möjligt för mikroorganismerna att använda motsträviga ämnen som näringsämnen 2,3. Dessa mikroorganismer kan därför övervägas för bioremedieringstekniker.
Bioremediering försöker mildra effekterna av föroreningar genom att använda mikroorganismer och deras enzymer för nedbrytning eller omvandling av avfall till mindre giftiga eller giftfria föreningar. Olika arter av arkéer, bakterier, alger och svampar har denna bioremedieringsförmåga4. Som ett resultat av deras speciella biologiska verkan är svampar särskilt lovande organismer för bioremediering. De kan attackera olika substrat med hjälp av deras hyphalnätverk, vilket gör det möjligt för dem att tränga in i jordmatrisen mer effektivt än andra mikroorganismer. Dessutom kan de nå otillgängliga mellanrum där föroreningar är svåra att ta bort5, och de kan också överleva låga fuktnivåer6. Dessutom syntetiserar svampar olika kassetter av ospecifika enzymer, vanligtvis för att bryta ner naturliga motsträviga ämnen såsom cellulosa, lignin och humana syror. De som saknar målsubstratet kan vara involverade i nedbrytningen av ett brett spektrum av motsträviga föroreningar, såsom kolväten, plast och bekämpningsmedel 7,8,9,10. Därför, även om många svamparter redan har rapporterats som bioremedieringsmedel, finns det ett ökande intresse för att utforska arter som ännu inte har studerats för att välja kandidater för bioremediering av motsträviga förorenande ämnen. De arter som redan är kända för att ha bioremedieringsegenskaper tillhör phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 och Mucoromycota. Till exempel är släktena Penicillium och Aspergillus välkända för att vara involverade i nedbrytningen av alifatiska kolväten13, olika plastpolymerer 16,17,18, tungmetaller 19 och färgämnen20. På liknande sätt har studier utförda på basidiomycetessvampar, såsom Phanerochaete chrysosporium och Trametes versicolor, avslöjat deras engagemang i oxidationen av motsträviga material såsom aromatiska kolväten13 och plast21. Ett annat exempel på svampar som är involverade i de biologiska nedbrytningsprocesserna är zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., och Cunninghamella spp.22,23. I synnerhet kan Cunninghamella oxidera aromatiska kolväten och anses vara en modellorganisme för att studera avgiftning av produkter från ett brett spektrum av xenobiotika13.
Det finns flera svampenzymer involverade i de stora nedbrytande processerna av motsträviga material 24,25, såsom esteras, laccase, peroxidas och proteas. Laccases är kopparinnehållande oxidaser som produceras i cellen och därefter utsöndras, som möjliggör oxidation av en mängd olika fenoliska och aromatiska föreningar. De kan bryta ner orto- och paradifenoler, aminogruppinnehållande fenoler, lignin och arylgruppinnehållande diaminer26. Peroxidaser använder väteperoxid som medlare för att bryta ner lignin och andra aromatiska föreningar. Det finns många olika peroxidaser, men de som har störst potential att bryta ner giftiga ämnen är ligninperoxidas och manganperoxidas27.
Esteraser och proteaser tillhör gruppen extra- eller ektocellulära enzymer, som verkar utanför sina ursprungsceller men fortfarande är bundna till dem. Dessa enzymer kan katalysera hydrolysen av stora motsträviga molekyler till mindre. På grund av deras låga substratspecificitet kan dessa enzymer spela en nyckelroll i bioremediering av olika föroreningar, såsom textilfärger, avloppsvatten som släpps ut från massa- och pappersindustrin och lädergarvning, petroleumprodukter, plast och bekämpningsmedel 28,29,30.
Ett antal screeningmetoder att välja för bioremedierande svampstammar har redan publicerats. Till exempel har halmbaserat agarmedium använts för att screena för vitrötsvampar med hög potential i nedbrytningen av polycykliska aromatiska kolväten (PAH)31; och små bitar av ruttnande trä har placerats på maltextraktagar (MEA) för att isolera trärötande svampar32. De flesta av de metoder som redan har föreslagits väljer emellertid mycket specifika svampar för deras aktivitet av intresse. Denna forskning föreslår ett bredare tillvägagångssätt för att välja marksvampar med ett bredare spektrum av åtgärder. Metoden bygger på initial plätering av seriella utspädningar av jordprover på ett medium som ändrats med humana syror eller lignocellulosa blandat med antibiotika för att välja svampar med förmågan att bryta ner dessa naturliga motsträviga ämnen. Humic syror och lignocellulosa är i själva verket ämnen som är extremt resistenta mot biologisk nedbrytning eftersom de har mycket komplexa molekylära strukturer, vilket gör att de kan vara utmärkta indikatorer på den nedbrytbara förmågan hos de testade svamparna33,34. Därefter screenas de svampar som valts ut i de första testerna för att identifiera de som har potential att bryta ned specifika föroreningar som petrolatum, begagnad motorolja och plast. Slutligen utförs kvalitativa enzymatiska tester för att detektera svampstammar som kan producera enzymer som är involverade i de biologiska nedbrytningsprocesserna av motsträviga ämnen. För detta ändamål utförs proteas- och esterastester, medan gallinsyra och guaiakol används som indikatorer på lakonfall och annan ligninolytisk enzymproduktion35,36. Dessa substrat används eftersom en stark korrelation har hittats mellan svamparnas förmåga att oxidera dem till sin brunfärgade form och innehavet av ligninolytisk förmåga 37,38,39.
Genom dessa protokoll är det möjligt att isolera svampstammar med hög nedbrytande potential och ett brett spektrum av verkan direkt från jordprover. Isoleringen av dessa svampstammar kan hjälpa till att hitta nya kandidater för bioremedieringsändamål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jordens rika biologiska mångfald är en riklig källa till svampar som har många metaboliska förmågor, varav några kan vara potentiella kandidater för bioremediering. Selektiva medietester (avsnitt 1 i protokollet) är enkla att utföra och effektiva metoder för att isolera svampar som kan växa på naturliga komplexa polymerer som sin enda kolkälla. Svampar kan producera extracellulära, ospecifika hydrolaser och oxidoreduktaser30 såsom de ligninolytiska enzymerna laccases och peroxidase…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) vid Universitetet i Pavia och professor Solveig Tosi för att ha gett möjlighet till detta arbete.
Materials
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
- Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
- Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation – A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
- Dix, N. J., Webster, J. . Fungal Ecology. , (1995).
- Magan, N., Esser, K., Lemke, P. A. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. 4, 99-114 (2007).
- Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
- Hasan, I. F., AI-Jawhari, V., Kumar, M., Kumar, R., Prasad, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. , (2018).
- Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
- Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
- Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
- Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
- Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 1-36 (2018).
- Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig’s Corrosion Handbook. , 421-438 (2011).
- Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, 224-239 (2019).
- DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
- El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
- Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
- Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
- Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
- Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
- Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
- Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
- Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , (2019).
- Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
- Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , (2019).
- Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
- Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
- Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
- Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
- Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
- Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
- Stevenson, F. J. . Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , (1995).
- Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
- Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
- Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
- Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
- Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
- Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
- Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
- Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
- Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
- Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
- Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).
