Labelvrije niet-lineaire optica voor de studie van tubuline-afhankelijke defecten in centrale myeline
Summary
In dit artikel presenteren we een protocol om microtubule-geladen oligodendrocyten te detecteren in een model van tubulinopathie door middel van een eenvoudige, innovatieve tweede harmonische generatie microscopiebenadering.
Abstract
De bevredigende visualisatie van cytoskeletale componenten in de hersenen is een uitdaging. De alomtegenwoordige verdeling van de netwerken van microtubuli, microfilamenten en intermediaire filamenten in alle neurale weefsels, samen met de variabiliteit in de uitkomsten van fluorescente eiwitfusiestrategieën en hun beperkte toepasbaarheid op dynamische studies van antilichamen en geneesmiddelen als chromofoorvoertuigen, maken klassieke optische benaderingen niet zo effectief als voor andere eiwitten. Wanneer tubuline moet worden bestudeerd, is de labelvrije generatie van tweede harmonischen een zeer geschikte optie vanwege de niet-centrosymmetrische organisatie van het molecuul. Deze techniek, wanneer geconjugeerd aan microscopie, kan kwalitatief de volumetrische verdeling van parallelle bundels microtubuli in biologische monsters beschrijven, met als bijkomend voordeel dat het werkt met verse weefsels die niet-gefixeerd en niet-gepermeabiliseerd zijn. Dit werk beschrijft hoe tubuline kan worden afgebeeld met een commerciële tweede harmonische generatie microscopie-opstelling om microtubuli in de met tubuline verrijkte structuren van de oligodendrocyten te markeren, zoals bij hypomyelinisatie met atrofie van de basale ganglia en cerebellum (H-ABC) tubulinopathie, een recent beschreven myelinestoornis.
Introduction
De optische beeldvorming van cytoskeletale structuren in weefsels en orgaanpreparaten is geen gemakkelijke taak. Cytoskeletale filamenten zijn alomtegenwoordig, dus als generieke kleuring wordt uitgevoerd, bijvoorbeeld tegen alfa-tubuline of bèta-actine of mogelijk keratine in een epitheelmonster, zal het signaal waarschijnlijk vrij homogeen over het monster worden verdeeld. Om de kleuring te beperken tot een meer betekenisvolle subset van cellulaire componenten, kan men transgene muizen gebruiken met gerichte expressie1 of van plan zijn om isovormspecifieke antilichamen te gebruiken. Hoewel er maar heel weinig van deze laatste op de markt zijn (en er maar heel weinig bestaan 2,3,4), kan een transgeen diermodel beschikbaar zijn. Het moet echter door het laboratorium worden verworven en op de juiste manier worden gehuisvest, met alle kosten die met het proces gemoeid zijn. Bepaalde antilichamen of chemicaliën, bijvoorbeeld fluorofoor-geconjugeerde geneesmiddelen zoals falloïdine of paclitaxel, kunnen gedeeltelijk of volledig onverenigbaar zijn met gebruik in levende cellen of weefsels, waardoor hun toepasbaarheid beperkt blijft tot alleen studies van vaste monsters.
In het geval van tubuline moet rekening worden gehouden met een bijkomend aspect, namelijk de gevoeligheid van het polymeer voor fixatie. Conventionele chemische fixatie met formaldehyde staat erom bekend dat het niet geschikt is om de integriteit van microtubuli optimaal te behouden5. Bovendien bevestigt een recent rapport dat formaldehyde-crosslinking subtiele veranderingen in de ultrastructuur van de microtubule induceert, vergelijkbaar met wat er gebeurt met de binding van sommige geneesmiddelen of fysiologische moleculen zoals GTP6.
De directe visualisatie van microtubuli in niet-gekleurde, niet-gefixeerde monsters is daarom vaak wenselijk. Om dit te bereiken, is een technische oplossing tweede harmonische generatie (SHG) microscopie7, die is gebaseerd op het vermogen van bundels parallelle microtubuli om als harmonoforen te fungeren en om frequentieverdubbeld licht uit te zenden wanneer het goed wordt verlicht met een intense, gepulseerde infraroodlaser. Hoewel een sterker en stabieler tweede harmonisch signaal kan worden gegenereerd uit collageen en myosine, de enige andere twee biologische materialen waarvan bekend is dat ze in staat zijn tot frequentieverdubbeling, is het signaal van tubuline tot nu toe vooral gebruikt om mitotische spindelherschikkingen 8,9,10 en axonale microtubulimorfologie 11,12,13 te bestuderen.
In dit werk introduceren we een nieuw gebruik van SHG-microscopie als een diagnostisch hulpmiddel om weefsels van het centrale zenuwstelsel (CZS) die zijn aangetast door tubuline bèta 4 A (TUBB4A) tubulinopathie te onderscheiden van hun gezonde tegenhangers14. Sommige van de mutaties die optreden in deze overwegend neurale isovorm van tubuline, zoals die welke hypomyelinisatie en atrofie van de basale ganglia en het cerebellum (H-ABC) veroorzaken, induceren microtubuli-overvulling in de oligodendrocyten15,16; de cytoskeletale veranderingen zijn op hun beurt geassocieerd met stroomafwaartse effecten zoals dysmyelinisatie, met diepgaande aantasting van de motorische en sensorische paden 16,17,18,19. Het taiep murine-model dat in dit werk wordt gebruikt, toont abnormaal microtubuligehalte in de oligodendrocyten en recapituuleert de meeste sensorisch-motorische symptomen van H-ABC-patiënten17. Het protocol legt uit hoe structuren kunnen worden afgebeeld als het corpus callosum en het cerebellum, die meestal sterk gemyeliniseerd zijn en die ernstig zijn aangetast bij menselijke patiënten en bij de taiep rat19, om de verschillen in SH-signalen tussen gezonde en mutante weefsels te benadrukken.
Protocol
Representative Results
Discussion
SHG-microscopie maakt deel uit van een groep niet-lineaire optische technieken, waaronder twee-foton excitatiemicroscopie, derde harmonische generatie microscopie en coherente anti-Stokes Raman verstrooiingsmicroscopie, die hebben bijgedragen aan het uitbreiden van het scala aan toepassingen van conventionele optische microscopie naar de levenswetenschappen20.
In het bijzonder hebben de belangrijkste sterkte en zwakte van SHG-microscopie betrekking op dezelfde toestand:…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) door middel van de volgende subsidies: infrastructuren 226450 tot VP-CIO, infrastructuren 255277 tot V.P. en FORDECYT-PRONACES/194171/2020 tot V.H. We erkennen de steun van Juvenal Hernández Guevara bij CIO bij het maken van video’s.
Materials
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
- Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
- Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
- Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
- Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
- Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Yu, C. -. H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
- Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
- Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
- Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
- Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
- Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
- Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
- Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
- Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
- Lopez-Juarez, A., et al. Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy. Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).
- Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
- Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
- Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
- Stoller, P., Kim, B. -. M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
- Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
- Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).
