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Neuroscience

चूहे एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की प्राथमिक संस्कृतियां और एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस के अध्ययन में उनका उपयोग

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63483
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Laser Microscopy, Institute for Physiology and Biochemistry “Jean Giaja”, University of Belgrade Faculty of Biology

Summary

हम यहां एचएसओडी 1जी 9 3 ए चूहे मॉडल में एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस के पैथोफिज़ियोलॉजी पर शोध के लिए इंट्रासेल्युलर सीए2 + के टाइम-लैप्स वीडियो इमेजिंग के लिए चूहे कॉर्टिकिस से ग्लियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की प्राथमिक संस्कृतियों को तैयार करने के तरीके पर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि स्प्राग डॉवले चूहों के कॉर्टिकिस से ग्लियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की प्राथमिक संस्कृतियों को कैसे तैयार किया जाए और चूहे एचएसओडी 1जी 9 3 ए मॉडल में एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) के पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के उद्देश्य से इन कोशिकाओं का उपयोग कैसे किया जाए। सबसे पहले, प्रोटोकॉल दिखाता है कि प्रसवोत्तर चूहे के कॉर्टिकिस से एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया को कैसे अलग और कल्चर किया जाए, और फिर एस्ट्रोसाइट्स के ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) मार्कर और आयनित कैल्शियम-बाइंडिंग एडाप्टर अणु 1 (आईबीए 1) माइक्रोग्लियल मार्कर का उपयोग करके इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा शुद्धता के लिए इन संस्कृतियों को कैसे चिह्नित और परीक्षण किया जाए। अगले चरण में, सुसंस्कृत कोशिकाओं के डाई-लोडिंग (कैल्शियम-संवेदनशील फ्लूओ 4-एएम) और लाइव कोशिकाओं पर वीडियो इमेजिंग प्रयोगों में सीए2 + परिवर्तनों की रिकॉर्डिंग के लिए विधियों का वर्णन किया गया है।

वीडियो रिकॉर्डिंग के उदाहरणों में शामिल हैं: (1) एएलएस रोगियों से अलग इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) के संपर्क में आने वाले सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स के सीए2 + इमेजिंग के मामले, एटीपी की प्रतिक्रिया की तुलना में एक विशेषता और विशिष्ट प्रतिक्रिया दिखाते हैं जैसा कि एक ही प्रयोग में दिखाया गया है। उदाहरण गैर-ट्रांसजेनिक नियंत्रणों की तुलना में एचएसओडी 1जी 9 3 ए एस्ट्रोसाइट्स में एएलएस आईजीजी द्वारा उत्पन्न इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता में अधिक स्पष्ट क्षणिक वृद्धि भी दिखाते हैं; (2) एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम सीए2 + एटीपीस के एक गैर-प्रतिस्पर्धी अवरोधक थाप्सिगार्गिन (टीएचजी) द्वारा कैल्शियम स्टोर की कमी के दौरान सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स की सीए2 + इमेजिंग, इसके बाद रिकॉर्डिंग समाधान में कैल्शियम के अतिरिक्त स्टोर-संचालित कैल्शियम प्रविष्टि, जो एचएसओडी 1जी 9 3 ए और गैर-ट्रांसजेनिक एस्ट्रोसाइट्स में सीए2 + स्टोर ऑपरेशन के बीच अंतर को दर्शाता है; (3) सुसंस्कृत माइक्रोग्लिया की सीए2 + इमेजिंग मुख्य रूप से एएलएस आईजीजी के प्रति प्रतिक्रिया की कमी दिखाती है, जबकि एटीपी एप्लिकेशन ने सीए2 + परिवर्तन प्राप्त किया। यह पेपर महत्वपूर्ण सेल घनत्व और संस्कृतियों की शुद्धता के बारे में संभावित चेतावनी और सावधानी पर भी जोर देता है, सीए2 + डाई और डाई-लोडिंग तकनीकों की सही एकाग्रता चुनता है।

Introduction

सेल कल्चर तकनीकों ने स्वास्थ्य और रोग में सेलुलर न्यूरोफिज़ियोलॉजी के विभिन्न क्षेत्रों में कई प्रगति को जन्म दिया है। विशेष रूप से, प्राथमिक कोशिका संस्कृतियां, एक प्रयोगशाला जानवर के न्यूरोनल ऊतक से ताजा पृथक, प्रयोगकर्ता को विभिन्न जैव रासायनिक मीडिया और शारीरिक सेटअपों में विविध कोशिकाओं के व्यवहार का बारीकी से अध्ययन करने की अनुमति देती हैं। टाइम-लैप्स वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में सीए2 + -संवेदनशील रंगों जैसे विभिन्न फ्लोरोसेंट शारीरिक संकेतकों का उपयोग करना वास्तविक समय में सेलुलर बायोफिज़िकल और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं में बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

एएलएस एक विनाशकारी न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी है जो ऊपरी और निचले मोटरन्यूरॉन्स को प्रभावित करती है। रोग में पारिवारिक प्रकार का एक जटिल रोगजनन होता है लेकिन ज्यादातर छिटपुट रूप (90% मामलों) का होता है। यह सर्वविदित है कि गैर-सेल स्वायत्त तंत्र एएलएस पैथोफिज़ियोलॉजी में योगदान करते हैं, मुख्य रूप से ग्लियलकोशिकाओं की आवश्यक भूमिका के कारण। एएलएस को सूजन के ह्यूमर और सेलुलर कारकों की भागीदारी के साथ एक न्यूरोइन्फ्लेमेटरी बीमारी के रूप में भी जाना जाता है।

इम्युनोग्लोबुलिन जी का व्यापक रूप से एएलएस और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में आणविक मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है। इस मार्कर के सीरम स्तर का अध्ययन रोग 4,5,6 में न्यूरोइन्फ्लेमेशन की उपस्थिति और चरण का संकेत दे सकता है, जबकि मस्तिष्कमेरु द्रव में इसकी उपस्थिति रक्त मस्तिष्क बाधा 7 के उल्लंघन का संकेत दे सकतीहै। आईजीजी को एएलएस रोगियों के रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स में जमा के रूप में भी पहचानागया था। फिर भी, इस दृष्टिकोण ने रोग के चरण और विशेषताओं के साथ आईजीजी के स्तर के सहसंबंध में कुछ विसंगतियां दिखाईहैं।

एएलएस रोगियों (एएलएस आईजीजी) के सेरा से अलग आईजीजी भोले एस्ट्रोसाइट्स8 और न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट रिलीज में कैल्शियम प्रतिक्रिया को प्रेरित कर सकता है, जो एक एक्साइटोटॉक्सिक प्रभाव की ओर इशारा करता है- एएलएस पैथोलॉजी9 की एक पहचान। हालांकि, एचएसओडी 1जी 9 3 ए एएलएस चूहा मॉडल (मानव एसओडी 1 उत्परिवर्तन10 की कई प्रतियां युक्त) पर अध्ययन ने सुसंस्कृत न्यूरोग्लियल कोशिकाओं 11, ऊतक12,13,14, या जीवित जानवरों 13 में ऑक्सीडेटिव तनाव के कई मार्कर दिखाए। यह उल्लेखनीय है कि एएलएस चूहे मॉडल से सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स गैर-ट्रांसजेनिक लिटरमेट्स11 से एस्ट्रोग्लिया की तुलना में पेरोक्साइड द्वारा प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए अधिक प्रवण थे।

संस्कृति में माइक्रोग्लियल कोशिकाएं एएलएस आईजीजी से कम स्पष्ट तरीके से प्रभावित होती हैं। अर्थात्, एक बीवी -2 माइक्रोग्लियल सेल लाइन ने केवल 4/11 एएलएस आईजीजी रोगी नमूने15 के आवेदन के जवाब में ऑक्सीडेटिव तनाव के फ्लोरोसेंट मार्करों से संकेत में वृद्धि प्रदर्शित की। यह सर्वविदित है कि माइक्रोग्लिया कई न्यूरोइन्फ्लेमेटरी विकृतियों में भाग लेते हैं, जो एएलएस16,17 के गैर-सेल स्वायत्त तंत्र में ऑक्सीडेटिव तनाव और देर से प्रगति चरण को जोड़ते हैं। फिर भी, एएलएस आईजीजी के साथ डेटा ने संकेत दिया कि ये कोशिकाएं एएलएस सूजन के इन ह्यूमरल कारकों के लिए एस्ट्रोसाइट्स के रूप में प्रतिक्रियाशील नहीं हो सकती हैं। एएलएस मुराइन मॉडल से प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स के साथ कई अध्ययन किए गए हैं, न केवल पिल्ले में बल्कि रोगसूचक जानवरों में भी, या तो मस्तिष्क पर या रीढ़ की हड्डीपर 18,19,20,21। यह माइक्रोग्लियल प्राथमिक संस्कृतियों के लिए भी सच है, हालांकि एस्ट्रोसाइट्स की तुलना में कुछ हद तक और भ्रूण चरण 22,23,24 पर मस्तिष्क क्षेत्रों से।

हम संस्कृति में कोशिकाओं पर सीए2 + के टाइम-लैप्स वीडियो इमेजिंग का उपयोग मुख्य रूप से एक्साइटोटॉक्सिसिटी के शारीरिक मार्कर के रूप में इस आयन के इंट्रासेल्युलर क्षणिकों का पालन करने के साधन के रूप में करते हैं। इस प्रकार, इन क्षणिकों (आयाम, क्षणिक, वृद्धि-समय, आवृत्ति के तहत क्षेत्र) के बायोफिज़िकल लक्षण वर्णन द्वारा शोधकर्ता न्यूरोडीजेनेरेशन के विभिन्न सेलुलर मॉडल से प्रयोगात्मक नैदानिक पैरामीटर प्राप्त कर सकता है। इस प्रकार यह तकनीक रोग बायोमाकर्स के रूप में आईजीजी के मात्रात्मक शारीरिक मूल्यांकन का लाभ प्रदान करती है। एएलएस के प्रेरण में आईजीजी और सीए2 + की भूमिका पर साहित्य का एक बड़ा निकाय है। इनमें से अधिकांश अध्ययन रोगी आईजीजी को प्रयोगात्मक जानवरों 25,26,27,28,29 में इंजेक्ट करके एएलएस को प्रेरित करके किए गए थे, जिसने तब इंट्रासेल्युलर सीए2 + ऊंचाई और आईजीजी जमाव दिखाया था। अध्ययनों की एक पंक्ति ने विट्रो30,31,32 में मोटर सिनैप्स पर एएलएस आईजीजी के प्रभाव का पता लगाया। उपरोक्त संदर्भ में, यहां प्रस्तुत तकनीक एएलएस के गैर-सेल स्वायत्त तंत्र में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में ग्लियल कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करती है और न्यूरोइन्फ्लेमेशन के ह्यूमरल कारकों के रूप में आईजीजी के लिए उनकी संभावित उत्तेजक प्रतिक्रिया को निर्धारित करती है। इस दृष्टिकोण का विभिन्न सेल कल्चर सिस्टम में और सामान्य सूजन के सेलुलर मॉडल में पूरे सेरा, सीएसएफ या साइटोकिन्स जैसे अन्य ह्यूमरल कारकों के परीक्षण में व्यापक अनुप्रयोग हो सकता है।

यह पेपर बताता है कि स्प्रैग डॉवले चूहों के कॉर्टिकिस से ग्लियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की प्राथमिक संस्कृतियों को कैसे तैयार किया जाए और रोगी सेरा-व्युत्पन्न आईजीजी के साथ एएलएस पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग कैसे किया जाए। प्रोटोकॉल सुसंस्कृत कोशिकाओं (चित्रा 1) की डाई-लोडिंग और टाइम-लैप्स वीडियो इमेजिंग प्रयोगों में सीए2 + परिवर्तनों की रिकॉर्डिंग के लिए विस्तृत हैं। वीडियो रिकॉर्डिंग के उदाहरण बताएंगे कि एटीपी की तुलना में ग्लियल कोशिकाएं एएलएस आईजीजी पर कैसे प्रतिक्रिया करती हैं, बाद में प्यूरीनर्जिक झिल्ली रिसेप्टर्स को सक्रिय करती हैं। पहली बार दिखाया गया है कि एचएसओडी 1जी 9 3 ए एएलएस चूहे के मस्तिष्क से अलग एस्ट्रोसाइट्स गैर-ट्रांसजेनिक नियंत्रणों की तुलना में एएलएस आईजीजी के लिए अधिक स्पष्ट सीए2 + प्रतिक्रिया के साथ कैसे प्रतिक्रिया करते हैं और इस प्रक्रिया को सीए2 + स्टोर ऑपरेशन में अंतर से कैसे संबंधित किया जाए। इसके अलावा दिखाया गया है कि माइक्रोग्लियल कोशिकाओं में कैल्शियम इमेजिंग का एक उदाहरण एएलएस आईजीजी के साथ तीव्र रूप से चुनौती दी गई है, जिसमें इंट्रासेल्युलर कैल्शियम की केवल मामूली प्रतिक्रिया है।

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Protocol

सभी प्रयोगवैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए जानवरों की सुरक्षा पर यूरोपीय संघ के निर्देशों के अनुसार और जीवविज्ञान संकाय, बेलग्रेड विश्वविद्यालय (अनुमोदन संख्या ईके-बीएफ-2016/08) के नैतिक आयोग की अनुमति के साथ किए गए थे। रोगी सामग्री (आईजीजी के लिए सेरा) के संबंध में, इसे मनुष्यों से जुड़े प्रयोगों के लिए वर्ल्ड मेडिकल एसोसिएशन (हेलसिंकी की घोषणा) के आचार संहिता के अनुसार सूचित रोगी की सहमति के साथ नियमित नैदानिक परीक्षा के लिए एकत्र किया गया था। प्रोटोकॉल को सर्बिया के क्लिनिकल सेंटर (नंबर 850/6) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. प्राथमिक सेल संस्कृति तैयारी

  1. मस्तिष्क ऊतक अलगाव
    नोट: बर्फ के ठंडे समाधानों का उपयोग करके बर्फ पर अलगाव किया जाना चाहिए।
    1. प्राथमिक नवजात कोशिका संस्कृति के लिए 1-3 दिन पुराने नवजातपिल्ले का उपयोग करें।
      नोट: यहां प्रस्तुत अध्ययन के लिए, स्प्राग डॉवले एचएसओडी 1जी 9 3 ए और गैर-ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग किया गया था। जीनोटाइपिंग के लिए, चूहे की पूंछ का उपयोग बाद में डीएनए निष्कर्षण और पीसीआर के लिए किया गया था।
    2. 70% इथेनॉल के साथ पिल्ले के सिर को छिड़कें और कैंची का उपयोग करके तुरंत इसे तेजी से काट दें।
    3. खोपड़ी को उजागर करने के लिए छोटे कोण वाली कैंची का उपयोग करके त्वचा को खोलें। फोरमेन मैग्नम से कक्षाओं की ओर एक कट बनाकर खोपड़ी खोलें। इसके बाद, एक लंबवत मध्य रेखा कटौती करें। खोपड़ी से मस्तिष्क को निकालें और इसे फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) युक्त पेट्री डिश में रखें।
      नोट: ट्रांसजेनिक और गैर-ट्रांसजेनिक पिल्ले के बीच क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए पिल्ले के बीच उपकरण साफ करें। मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से कॉर्टिक का अलगाव एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत किया जाना चाहिए।
    4. बल की नोक का उपयोग करके, दोनों गोलार्धों के बीच के कनेक्शन को फाड़ दें। फिर, एक गोलार्ध को धीरे से केंद्र से साइड में धकेलकर घुमावदार बल के साथ गोलार्धों को अलग करें।
    5. सीधे और घुमावदार बल के साथ सावधानीपूर्वक फाड़कर मेनिंग को हटा दें।
    6. हिप्पोकैम्पस को घुमावदार बल से चुटकी मारकर निकालें। हिप्पोकैम्पस को त्याग दें या इसे किसी अन्य सेल संस्कृति की तैयारी के लिए उपयोग करें।
      नोट: बाँझ स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए लैमिनार प्रवाह हुड के तहत आगे के चरण किए जाने चाहिए।
  2. ऊतक समरूपीकरण और पृथक्करण
    1. एक कॉर्टेक्स को 3 एमएल ठंडे पीबीएस से भरे 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। निलंबन को 1 एमएल टिप के साथ ऊपर और नीचे करें, 10-15 स्ट्रोक पूरा करें जब तक कि निलंबन सजातीय न हो जाए।
      नोट: इस प्रक्रिया में बुलबुले पैदा न करने के लिए बहुत सावधान रहें।
    2. 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को निकालें और गोली को 1 एमएल टिप के साथ ऊपर और नीचे करके 3 एमएल ठंडे पीबीएस में फिर से निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूजेशन चरण दोहराएँ।
      नोट: इस बिंदु से उपयोग किए जाने वाले सभी समाधानों को 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्वप्रमाणित किया जाना चाहिए।
    3. सुपरनैटेंट को छोड़ दें और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक पूर्ण डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) के 2 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। होमोजेनेट को 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. एकल कोशिकाओं का निलंबन करने के लिए होमोजेनेट को 21 जी और 23 जी सुइयों (प्रत्येक तीन बार) के माध्यम से पारित करें।
      नोट: इस प्रक्रिया में बुलबुले पैदा न करने के लिए बहुत सावधान रहें।
  3. एक कॉर्टेक्स से तैयार सेल सस्पेंशन को 60 मिमी व्यास पेट्री डिश या टी 25 फ्लास्क (सतह के साथ अनुयायी कोशिकाओं के विकास के लिए पॉलीपेप्टाइड कोटिंग के साथ पूर्व-उपचारित) में डालें जिसमें 3 एमएल पूर्ण डीएमईएम हो। पेट्री डिश को हल्के से हिलाएं ताकि निलंबन समान रूप से वितरित हो।
  4. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2/95% हवा के आर्द्र वातावरण में उगाएं।
  5. अलगाव के बाद 48 घंटे के बाद माध्यम बदलें और हर 3 दिनों में माध्यम को बदलें।
  6. एस्ट्रोसाइट विकास को बढ़ावा देने के लिए, जब कोशिकाएं 70% -80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो उन्हें माध्यम में शिथिल रूप से संलग्न ग्लियल कोशिकाओं और एफबीएस के निशान को हटाने के लिए पूर्वनिर्मित पीबीएस के साथ धो लें।
    1. ट्रिप्सिन एस्ट्रोसाइट्स की अंतर्निहित परत को प्रीवार्ड ट्रिप्सिन समाधान के 1 एमएल (पीबीएस में 0.25% ट्रिप्सिन, 0.02% ईडीटीए, बाँझ-फ़िल्टर) जोड़कर ट्राइप्सिनाइज़ करें।
    2. डिश को इनक्यूबेटर में 2-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    3. माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जांच करें। जब वे अलग होना शुरू करते हैं, तो पूर्ण डीएमईएम के 4 एमएल जोड़ें।
    4. सेल निलंबन एकत्र करें और इसे 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    5. सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और गोली को पूर्ण माध्यम के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    6. ताजा पूर्ण डीएमईएम के 5 एमएल में 104 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर कोशिकाओं को पुन: प्राप्त करें।
  7. हर 3 दिन में माध्यम बदलें। अन्य ग्लियल सेल प्रकारों की उपस्थिति को कम करने के लिए, एस्ट्रोसाइट्स 50% संगम तक पहुंचने के बाद और प्रत्येक मीडिया प्रतिस्थापन से पहले, कोशिकाओं को पूर्ण डीएमईएम के साथ धोएं।
    1. 1 एमएल पिपेट के साथ सुपरनैटेंट माध्यम को एस्पिरेट करें और धीरे से इसे कई बार कोशिकाओं की परत पर वितरित करें। सुनिश्चित करें कि इस धोने के चरण के दौरान सेल परत की पूरी सतह को कवर किया गया है।
  8. एक बार जब कोशिकाएं 80% संगम (आमतौर पर 14 दिनों के बाद) तक पहुंच जाती हैं, तो ट्रिप्सिनाइजेशन और एस्ट्रोसाइट्स के संग्रह को दोहराएं जैसा कि चरण 1.6 में वर्णित है।
  9. बीज 5 × 103 एस्ट्रोसाइट्स 7 मिमी गोलाकार ग्लास कवरस्लिप पर पॉली-एल-लाइसिन (50 μg / mL) के साथ लेपित। 48 घंटे के बाद प्रयोगों में उनका उपयोग करें।
  10. माइक्रोग्लिया को बढ़ावा देने के लिए, चरण 1.7 के बाद, ग्लियल कोशिकाओं को एक कंफ्लुएंट परत34 तक पहुंचने की अनुमति दें। जब माइक्रोग्लियल कोशिकाएं एस्ट्रोसाइट परत के शीर्ष पर दिखाई देती हैं (10-15 दिनों के बाद, उनके छोटे, अधिक अंडाकार निकायों और छोटी प्रक्रियाओं द्वारा मान्यता प्राप्त), पेट्री डिश को 220 आरपीएम पर 2 घंटे के लिए कक्षीय शेकर पर हिलाते हैं।
  11. माइक्रोग्लियल कोशिकाओं को फैलाना और सीडिंग करना
    1. 1 एमएल पिपेट टिप के साथ सतह पर तैरने वाले माध्यम को एस्पिरेटेड करके अलग और शिथिल रूप से संलग्न कोशिकाओं को हल्के से धोएं और धीरे से इसे कई बार कोशिकाओं की परत पर वितरित करें। इस धोने के चरण के दौरान सेल परत की पूरी सतह को कवर करना सुनिश्चित करें, अलग कोशिकाओं के साथ माध्यम एकत्र करें, और इसे 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और गोली को 1 एमएल माध्यम में पुन: निलंबित करें।
    3. एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 21 जी सुई के माध्यम से सेल निलंबन पारित करें।
      नोट: अधिकांश प्रकाशित विधियां ऊतक को अलग करने के लिए ट्रिप्सिन या पपैन का उपयोग करती हैं; हालांकि, 21 जी सुइयों में कोशिकाओं के अतिचक्राव को रोकने का लाभ होता है, जिससे कोमल पृथक्करण की अनुमति मिलती है।
    4. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। बीज 5 × 7 मिमी गोलाकार ग्लास कवरस्लिप पर 103 माइक्रोग्लियल कोशिकाएं पॉली-एल-लाइसिन (50 μg / mL) के साथ लेपित होती हैं। 48 घंटे के बाद प्रयोगों में उनका उपयोग करें।
      नोट: हिलाकर शुद्ध माइक्रोग्लियल संस्कृति प्राप्त करना मुश्किल है, क्योंकि ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाएं और एस्ट्रोसाइट्स अभी भी प्रयोगकर्ता के अनुभव के आधार पर एक चर संख्या में मौजूद हो सकते हैं। ग्लियल संस्कृतियों में विभिन्न सेल आबादी की उपस्थिति का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले इम्यूनोसाइटोकेमिकल प्रोटोकॉलको कहीं और वर्णित किया गया है।

2. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री

  1. पीबीएस में कवरलिप्स पर चढ़ाए गए कोशिकाओं को कुल्ला करें, 2 x 1 मिनट।
  2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ठीक करें।
  3. पीबीएस में 3 x 5 मिनट धो लें।
  4. आरटी में 45 मिनट के लिए 10% सामान्य गधे सीरम (एनडीएस)/1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए)/0.1% ट्राइटन एक्स -100 युक्त ब्लॉकिंग घोल में इनक्यूबेट करें।
    1. प्रति 10 मिमी व्यास कवरस्लिप में एक ब्लॉकिंग समाधान का 50 μL जोड़ें।
  5. निम्नलिखित कमजोर पड़ने में 1% एनडीएस / 1% बीएसए / 0.1% ट्राइटनएक्स -100 में प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें: माउस एंटी-जीएफएपी 1: 300, बकरी एंटी-आईबीए 1 1: 500। +4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. पीबीएस में कुल्ला करें, 3 x 10 मिनट।
  7. फ्लोरोफोरे के साथ संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें: गधा एंटी-माउस (उत्तेजना 488 एनएम [1:200]) या गधा विरोधी बकरी (647 एनएम [1:200] पर उत्तेजित)। अंधेरे में आरटी में 2 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  8. पीबीएस में धो लें, 7 x 5 मिनट।
  9. आरटी में 10 मिनट के लिए 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई, 1: 4,000) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  10. पीबीएस 5 x 5 मिनट में धो लें।
  11. एक बढ़ते समाधान का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कवरलिप्स माउंट करें; प्रति कवरलिप इसकी एक बूंद का उपयोग करें।
    नोट: एंटीबॉडी कमजोर पड़ने उत्पादक के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। उपयोगकर्ताओं को अपने प्रयोगों के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने का निर्धारण करना चाहिए।

3. टाइम-लैप्स वीडियो इमेजिंग

नोट: फ्लोरोसेंट डाई युक्त समाधान प्रत्यक्ष प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए। इमेजिंग प्रयोग शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि छिड़काव चालू करते समय ग्लास कवरस्लिप नहीं चलता है।

  1. समाधान और कोशिकाओं की तैयारी
    1. इमेजिंग के लिए बाह्य समाधान (ईसीएस) तैयार करें: 140 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम केसीएल, 2 एमएम सीएसीएल2, 2 एमएम एमजीसीएल2, 10 एमएम डी-ग्लूकोज, और 10 एमएम एचईपीईएस। pH को 7.4 पर समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि परासरणता 280-300 mOsm / kg है और Ca2 +: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-Glucose, 10 mM HEPES, और 0.1 mM EGTA के बिना ईसीएस तैयार करें।
    2. परीक्षण समाधान तैयार करें: ईसीएस में घुलने वाले 100 μM एटीपी, Ca2+ के बिना ECS में 1 μM Thg, और ECS8 में 0.1 mg / mL ALS IgG।
    3. पूर्ण डीएमईएम को धोने के लिए ईसीएस के साथ एक कवरलिप को डिश में स्थानांतरित करें। ईसीएस के साथ फ्लूओ -4 एएम के 1 एमएम स्टॉक समाधान को 5 μM Fluo-4 AM की अंतिम एकाग्रता तक पतला करके डाई लोडिंग समाधान तैयार करें।
      1. अंधेरे में आरटी में 30 मिनट के लिए डाई लोडिंग समाधान में कोशिकाओं के साथ कवरस्लिप रखें। कोशिकाओं को ईसीएस में 20 मिनट के लिए धो लें।
    4. यदि कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से लोड नहीं किया जाता है (यानी, यदि प्रतिदीप्ति का बेसल स्तर 400 एमएस से अधिक एक्सपोजर समय के साथ कैमरे की गतिशील सीमा का बहुत कम-<5% है), तो लोडिंग समय को 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट से 1 घंटे तक बढ़ाएं। वैकल्पिक रूप से, ईसीएस में पतला करने से पहले डीएमएसओ में 20% (डब्ल्यू / वी) डिटर्जेंट (प्लूरोनिक) की समान मात्रा के साथ फ्लूओ -4 एएम स्टॉक समाधान मिलाएं, जिससे अंतिम प्लूरोनिक एकाग्रता ~ 0.02% हो जाती है।
      नोट: इस अध्ययन के प्रयोगात्मक उदाहरण ों को एएलएस रोगियों के रक्त सेरा से अलग मानव आईजीजी के साथ किया गया था जैसा कि पहलेवर्णित 4,5,11 था। प्रत्येक प्रयोग एक ही रोगी के आईजीजी नमूनों के साथ किया गया था।
  2. वीडियो इमेजिंग
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, वीडियो इमेजिंग सिस्टम को एक क्सीनन शॉर्ट आर्क लैंप, एक पॉलीक्रोमेटर सिस्टम और पानी, ग्लिसरीन और तेल विसर्जन उद्देश्य से लैस एक उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ जोड़ा गया था। टाइमलैप्स इमेजिंग एक डिजिटल कैमरा सिस्टम का उपयोग करके किया गया था।
    1. सिस्टम को काम के तापमान तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए प्रयोग से 15 मिनट पहले इमेजिंग सेटअप के घटकों को चालू करें।
    2. कवरस्लिप को रिकॉर्डिंग कक्ष में 1 एमएल कामकाजी समाधान (सीए2 + के बिना ईसीएस या ईसीएस) के साथ रखें।
    3. सही इमेजिंग प्रोटोकॉल चुनने के लिए, इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और अधिग्रहण पैनल में, 480 एनएम पर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, 505 एनएम पर एक डाइक्रोइक दर्पण और 535 एनएम पर उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ फ्लू4-एएम के लिए फ़िल्टर जोड़े चुनें।
    4. प्रयोग के दौरान कोशिकाओं की एक सुसंगत संख्या रखने के लिए ध्यान रखने वाले दृश्य के क्षेत्र का चयन करें। एक्सपोज़र समय और डिटेक्टर लाभ को उचित रूप से समायोजित करें, इस तरह से कि सिग्नल संतृप्त न हो। अधिग्रहण के लिए स्यूडोकलर मोड चुनें। अधिक विस्तृत निर्देशों के लिए, निर्माता द्वारा प्रदान किए गए मैनुअल को देखें।
    5. नमूना दर को 1 हर्ट्ज (1 फ्रेम प्रति सेकंड) में समायोजित करें।
    6. बेसलाइन निर्धारण (एफ0) के लिए 3-5 मिनट के लिए प्रतिदीप्ति के बेसल स्तर को प्राप्त करके इमेजिंग शुरू करें। काम करने वाले समाधान का निरंतर प्रवाह सुनिश्चित करें।
    7. काम करने वाले समाधान के प्रवाह को रोकें और वांछित लंबाई के लिए परीक्षण समाधान पर स्विच करें ( चित्रा 2 और चित्रा 3 के उदाहरणों में समय सलाखों को भी देखें)। प्रत्येक परीक्षण समाधान के बीच, 3-5 मिनट के लिए काम करने वाले समाधान के निरंतर प्रवाह के साथ कोशिकाओं को धोएं।
    8. समाधान के शीर्ष से निरंतर सक्शन की व्यवस्था करके रिकॉर्डिंग कक्ष में समाधान की मात्रा ~ 1 एमएल रखें ( चित्रा 2 ई देखें)।
      नोट: छवि कोशिकाओं पर सीधे उपचार लागू करने के लिए, ग्लास पिपेट (0.8 मिमी आंतरिक व्यास) से बना एक अनुकूलित वितरण प्रणाली को कोशिकाओं के ऊपर ~ 350 μm दूर और ~ 1 मिमी, 45 ° के कोण पर पिंच वाल्व और इलेक्ट्रॉनिक वाल्व नियंत्रक युक्त समाधान विनिमय प्रणाली के साथ संयुक्त किया गया था ( चित्रा 2 ई देखें)।

4. डेटा विश्लेषण

  1. रुचि के एक क्षेत्र (ROI) को परिभाषित करें जो व्यक्तिगत सेल से मेल खाता है।
    1. उच्चतम सिग्नल तीव्रता (यानी, एटीपी के आवेदन से) के साथ फ्रेम चुनें और एप्लिकेशन पॉलीगोनल टूल का उपयोग करके एक सेल को घेर लें। अधिग्रहित क्षेत्र में सभी कोशिकाओं के लिए दोहराएं। सर्कल टूल का उपयोग करके पृष्ठभूमि में पांच ROIs चुनें।
    2. एकल सेल की औसत सिग्नल तीव्रता और प्रत्येक समय सीमा के लिए पृष्ठभूमि को मापने के लिए, सभी आरओआई का चयन करें और इमेजजे में आरओआई प्रबंधक में मल्टी मेजर कमांड या वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर में किसी भी समकक्ष कमांड का उपयोग करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. एक स्प्रेडशीट के रूप में आरओआई के औसत सिग्नल तीव्रता मूल्यों को निर्यात करें।
  3. औसत पांच पृष्ठभूमि आरओआई और एक ही समय में प्राप्त फ्रेम की औसत आरओआई तीव्रता से प्रत्येक फ्रेम की औसत पृष्ठभूमि को घटाएं।
  4. प्राप्त डेटा को बेसलाइन सिग्नल पर सामान्य करने के लिए, समीकरण (1) का उपयोग करें:
    3F/F0 = (F - F0)/F0 (1)
    जहां एफ पृष्ठभूमि घटाव के बाद प्रत्येक समय सीमा की सिग्नल तीव्रता है, और एफ0 बेसलाइन फ्लूओ -4 फ्लोरेसेंस है।
    नोट: इस अध्ययन में एक कस्टम-निर्मित कोड का उपयोग किया गया था।
  5. कैल्शियम गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए, कई पैरामीटरनिर्धारित करें 4: कैल्शियम पीक का आयाम (एएफ / एफ0), कैल्शियम क्षणिक का एकीकृत परिवर्तन (समय अभिन्न, प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग के तहत सतह), उत्तेजना की शुरुआत से अधिकतमकैल्शियम × क्षणिक (एस) तक समय-से-शिखर-बीतने का समय, उत्तेजना की शुरुआत से लेकर अधिकतम कैल्शियम क्षणिक (एस) तक समय-समय बीत जाता है, उत्तेजना की शुरुआत से लेकर एएफ / एफ0 के मूल्य तक समय-समय बीत जाता है। जो अधिकतम आयाम (एस) के 50% -80% तक पहुंचता है, आधे-अधिकतम आयाम (एस) पर क्षणिक की आधी चौड़ाई-पूर्ण चौड़ाई, प्रतिक्रियाओं की आवृत्ति यदि वे दोहराए जाते हैं (हर्ट्ज)।

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Representative Results

संस्कृति में विभिन्न ग्लियल सेल प्रकारों का लक्षण वर्णन
प्रयोगों के लिए एस्ट्रोसाइट्स का उत्पादन करने में आमतौर पर 15-21 दिन लगते हैं, जबकि माइक्रोग्लियल कोशिकाओं को बढ़ने में 10-15 दिन लगते हैं। संस्कृति की कोशिका शुद्धता का आकलन करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग किया गया था। चित्र 1 संबंधित संस्कृतियों में एस्ट्रोसाइटिक मार्कर जीएफएपी और माइक्रोग्लियल मार्कर आईबीए 1 के डबल लेबलिंग की अभिव्यक्ति को दर्शाता है।

कैल्शियम इमेजिंग स्वस्थ और रोगग्रस्त एस्ट्रोसाइट्स के सेल फिजियोलॉजी में अंतर को प्रकट करने के लिए जाना जाता है। पहले जंगली प्रकार के एस्ट्रोसाइट्स में, हमने दिखाया कि एएलएस आईजीजी साइटोसोल8 में इंट्रा- और बाह्य पूल को जुटाकर सेलुलर सीए2 + को प्रभावित करता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ने निर्धारित किया कि क्या एचएसओडी 1जी 9 3 ए और गैर-ट्रांसजेनिक सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स में कैल्शियम क्षणिकों के बीच अंतर थे जो रोगियों से एएलएस आईजीजी नमूनों के संपर्क में थे। फ्लू4-एएम से भरे एस्ट्रोसाइट्स को स्थिर आधार रेखा प्राप्त करने के लिए 3 मिनट के लिए ईसीएस के साथ जोड़ा गया था। इसके बाद, 100 μg / mL ALS IgG को 5 मिनट के लिए स्नान में लागू किया गया था। एस्ट्रोसाइट्स को ईसीएस के साथ धोया गया था, और फिर प्रत्येक सेल के स्वास्थ्य का परीक्षण करने और एक मानक उत्तेजना के लिए कैल्शियम प्रतिक्रिया का निरीक्षण करने के लिए प्रत्येक रिकॉर्डिंग के अंत में 100 μM एटीपी लागू किया गया था।

चित्रा 2 ए, बी में प्रतिनिधि निशान से पता चलता है कि एचएसओडी 1जी 9 3 ए एस्ट्रोसाइट्स कैल्शियम क्षणिक के अधिक आयाम, एक बड़े समग्र एकीकृत परिवर्तन और गैर-ट्रांसजेनिक एस्ट्रोसाइट्स की तुलना में कम समय-से-शिखर के साथ एएलएस आईजीजी का जवाब देते हैं। यहां, हालांकि, किसी को मात्रात्मक डेटा की व्याख्या करने में सावधानी बरतनी चाहिए जब एकल-तरंग दैर्ध्य सीए2 + -जांच जैसे कि फ्लू4-एएम का उपयोग किया जाता है (चर्चा अनुभाग देखें)। इसके अतिरिक्त, एएलएस आईजीजी की प्रतिक्रिया का रूप एटीपी की प्रतिक्रिया से अलग है (एटीपी, चित्रा 2 ए, बी के जवाब में स्यूडोकलर छवियों में निशान और सेल सिंक्रोनिसिटी में अधिक आयाम के साथ तेजी से क्षणिक नोट करें)।

एचएसओडी 1जी 9 3 ए और गैर-ट्रांसजेनिक एस्ट्रोसाइट्स के बीच एएलएस आईजीजी और एटीपी के लिए कैल्शियम प्रतिक्रिया में अंतर की उत्पत्ति का अध्ययन करने के लक्ष्य के साथ, हमने 1 μM Thg का उपयोग करके कैल्शियम इमेजिंग के दौरान आंतरिक Ca 2 +स्टोर में हेरफेर करने के लिए एक औषधीय दृष्टिकोण का उपयोग किया। Thg एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम Ca2 + ATPase (SERCA) का एक गैर-चयनात्मक अवरोधक है। इंट्रासेल्युलर सीए2 + स्टोर को लगभग तुरंत कम करना, जो कई मिनटों तक चलने वाले कैल्शियम क्षणिक में परिलक्षित होता है। अवलोकन की गई घटनाओं में बाहरी सीए2 + के प्रभाव को बाहर करने के लिए, प्रयोग के दौरान सीए2 + से वंचित ईसीएस का उपयोग किया गया था। 3 मिनट के लिए प्रतिदीप्ति के बेसल स्तर को रिकॉर्ड करने के बाद, 2 मिनट के लिए स्नान में 1 μM Thg लागू किया गया था। टीएचजी-प्रेरित कैल्शियम की कमी के बाद, एस्ट्रोसाइट्स को स्टोर के रिफिलिंग को प्रेरित करने और निगरानी करने के लिए सीए2 + युक्त ईसीएस के साथ संक्रमित किया गया था। वर्णित प्रयोग के प्रतिनिधि निशान चित्रा 2 सी, डी में दिखाए गए हैं। जैसा कि अपेक्षित था, एचएसओडी 1जी 9 3 ए एस्ट्रोसाइट्स में स्टोर में सीए2 + का उच्च स्तर था, जैसा कि स्टोर की कमी से पता चला है, जो इस आयन के अधिभार का संकेत देता है। एसओडी 1जी 9 3 ए ट्रांसजेनिक चूहों36 से सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स में एक समान तंत्र का प्रदर्शन किया गया है।

संस्कृति में माइक्रोग्लियल कोशिकाओं की कैल्शियम इमेजिंग
फ्लूओ -4 एएम के साथ लेबल किए गए माइक्रोग्लिया की टाइमलैप्स इमेजिंग उसी तरह से की गई थी जैसे एस्ट्रोसाइट्स (चित्रा 3 बी) के लिए वर्णित है। माइक्रोग्लियल कोशिकाओं को स्थिर आधार रेखा प्राप्त करने के लिए 3 मिनट के लिए 2 एमएम सीए2 + के साथ ईसीएस के साथ जोड़ा गया था, इसके बाद 5 मिनट के लिए 100 μg / mL ALS IgG का स्नान आवेदन, ईसीएस के साथ धोना, और 100 μM एटीपी के साथ उत्तेजना। दिलचस्प बात यह है कि, जबकि एस्ट्रोसाइट्स एएलएस आईजीजी का आसानी से जवाब देते हैं, माइक्रोग्लियल कोशिकाओं के एक विशाल बहुमत ने एएलएस आईजीजी का जवाब नहीं दिया (जैसा कि कैल्शियम क्षणिक के साथ प्रतिक्रिया करने वाले केवल एक माइक्रोग्लियल सेल द्वारा चित्रित किया गया है; चित्रा 3 ए के उदाहरण में लाल निशान)। हालांकि, उन्होंने हमेशा एटीपी का जवाब दिया और एस्ट्रोसाइट्स (चित्रा 3 ए) के समान तरीके से। सेल ट्रेस 2 (चित्रा 3 ए) में एक सहज सीए2 + क्षणिक का मामला भी नोट करें जिसे प्रेरित प्रतिक्रिया के रूप में गलत नहीं माना जाना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: एक प्राथमिक संस्कृति में एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया। संस्कृति में एस्ट्रोसाइट्स (बाएं) की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियों को जीएफएपी (लाल) और माइक्रोग्लिया (दाएं) का उपयोग करके लेबल किया गया है। डबल लेबलिंग (जीएफएपी / आईबीए 1) का उपयोग संस्कृति शुद्धता को इंगित करने के लिए किया गया था। DAPI का उपयोग नाभिक (नीले) को लेबल करने के लिए किया गया था। स्केल सलाखों = 50 μm. संक्षेप: जीएफएपी = ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन; एलबीए 1 = आयनित कैल्शियम-बाइंडिंग एडाप्टर अणु 1; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(A) कैल्शियम इमेजिंग प्रयोग का एक प्रतिनिधि उदाहरण जहां एचएसओडी 1जी 9 3 ए एस्ट्रोसाइट्स को बेसलाइन फ्लोरेसेंस ('बेसलाइन') एकत्र करने के लिए 5 मिनट के लिए चित्रित किया गया था, इसके बाद 5 मिनट के लिए एएलएस आईजीजी (0.1 मिलीग्राम / एमएल) का तीव्र अनुप्रयोग ('एएलएस आईजीजी की प्रतिक्रिया'), और 100 μM एटीपी ('एटीपी की प्रतिक्रिया') के साथ एक उपचार। शीर्ष पैनल स्यूडोकलर छवियों को दिखाता है (प्रतिदीप्ति की तीव्रता रंग-कोडित होती है, जहां काला बहुत कम तीव्रता से मेल खाता है, जबकि सफेद उच्चतम तीव्रता वाले पिक्सेल को चिह्नित करता है; रंग-तीव्रता संबंध को बी के शीर्ष पैनल में दाईं ओर एक रंग पट्टी में दर्शाया जाता है जो प्रयोग के प्रत्येक खंड में एक व्यक्तिगत सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता से मेल खाता है ('बेसलाइन', 'एएलएस आईजीजी के लिए प्रतिक्रिया', और 'एटीपी के लिए प्रतिक्रिया')। ग्रे डैश्ड लाइनें प्रतिनिधि कैल्शियम ट्रेस (नारंगी में) के लिए विशिष्ट समय बिंदुओं की छद्म रंग छवियों को इंगित करती हैं। कैल्शियम ट्रेस के बीच में ग्रे बॉक्स एएलएस आईजीजी के 5 मिनट के आवेदन को चिह्नित करता है। कैल्शियम ट्रेस के नीचे ब्लैक बार एटीपी के आवेदन को चिह्नित करता है। (बी) गैर-ट्रांसजेनिक एस्ट्रोसाइट्स (नीले रंग में ट्रेस) को छोड़कर (ए) में समान है। (सी) एचएसओडी 1जी 9 3 ए एस्ट्रोसाइट में एक प्रतिनिधि कैल्शियम ट्रेस (नारंगी) कैल्शियम के बिना ईसीएस में 1 μg / mL thapsigargin (ट्रेस के नीचे काली पट्टी) के साथ चुनौती दी गई, इसके बाद 2 mM Ca2 + ('2 mM Ca2+', ट्रेस के तहत ब्लैक बार) को जोड़ा गया। (डी) गैर-ट्रांसजेनिक एस्ट्रोसाइट (ट्रेस नीले रंग में है) को छोड़कर (सी) के समान है। आयाम पैमाने = 100% ऍF/ F0। समय पैमाना = 200 सेकंड। स्केल बार = 50 μm. (E) प्रयोगात्मक सेटअप की योजना जो समाधान विनिमय के कस्टम-निर्मित मोड और जैव रासायनिक एजेंट अनुप्रयोग के लिए पिपेट के प्लेसमेंट को दर्शाती है। संक्षेप: एएलएस = एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस; आईजीजी = इम्युनोग्लोबुलिन जी; thg = thapsigargin. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: सुसंस्कृत माइक्रोग्लिया की कैल्शियम इमेजिंग का एक उदाहरण। (ए) बाएं: सुसंस्कृत माइक्रोग्लिया की ब्राइटफील्ड छवि। चूंकि शुद्ध माइक्रोग्लियल संस्कृति प्राप्त करना मुश्किल है, इसलिए एस्ट्रोसाइट्स यहां भी मौजूद हैं (बड़ी सपाट बहुभुज कोशिकाएं, तीर द्वारा इंगित उदाहरण देखें)। दोनों रामिफाइड (छोटे सोमा, प्रमुख प्रक्रियाएं) और अमीबॉइड माइक्रोग्लिया (क्रमशः हरे और पीले बक्से के साथ इंगित) संस्कृति में मौजूद हैं। मध्य: बाईं ओर से बढ़े हुए पीले और सियान बक्से। लाल, नीली और बैंगनी रेखाएं आरओआई को चिह्नित करती हैं जिसमें से समय के साथ औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता निकाली जाती है। दाएं: मध्य पैनल में तीन कोशिकाओं के कैल्शियम के निशान। ट्रेस का रंग मध्य पैनल में आरओआई के रंग से मेल खाता है। 200 सेकंड के लिए बेसलाइन कैल्शियम फ्लोरेसेंस ('बेसलाइन फ्लोरेसेंस') की इमेजिंग के बाद, कोशिकाओं को 5 मिनट ('एएलएस आईजीजी की प्रतिक्रिया') के लिए एएलएस आईजीजी (0.1 मिलीग्राम / एमएल) के तीव्र अनुप्रयोग के संपर्क में लाया गया, इसके बाद 100 μM एटीपी ('एटीपी की प्रतिक्रिया')। कैल्शियम ट्रेस के बीच में ग्रे बॉक्स एएलएस आईजीजी के 5 मिनट के आवेदन को चिह्नित करता है। कैल्शियम ट्रेस के नीचे काली पट्टी एटीपी के आवेदन को चिह्नित करती है। ध्यान दें कि कोशिकाओं के एक बड़े अल्पसंख्यक का प्रतिनिधित्व करने वाले केवल सेल 1 (लाल ट्रेस) ने एएलएस आईजीजी का जवाब दिया, जबकि सभी कोशिकाओं ने एटीपी का जवाब दिया। (बी) स्यूडोकलर छवियां रिकॉर्डिंग के प्रत्येक खंड ('बेसलाइन', 'एएलएस आईजीजी की प्रतिक्रिया', और 'एटीपी की प्रतिक्रिया') में प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करती हैं, जहां नारंगी डैश लाइनें प्रतिनिधि कैल्शियम निशान (ए, दाएं पैनल) में विशिष्ट समय बिंदुओं को इंगित करती हैं। हरे और नारंगी बक्से अमीबॉइड माइक्रोग्लिया ( ए के समान) को चिह्नित करते हैं। रंग-तीव्रता संबंध को दाईं ओर एक रंग पट्टी में दर्शाया गया है। आयाम पैमाने = 100% ऍF/ F0। समय पैमाने = 100 सेकंड। स्केल सलाखों = 50 μm. संक्षेप: एएलएस = एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस; आईजीजी = इम्युनोग्लोबुलिन जी; ROI = रुचि का क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह पेपर प्राथमिक सेल संवर्धन की विधि को चूहे एचएसओडी 1जी 9 3 ए मॉडल में एएलएस जैसे सेल (पैथो) फिजियोलॉजी के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक तेज और "बजट पर" उपकरण के रूप में प्रस्तुत करता है। इस प्रकार तकनीक एकल-कोशिका स्तर पर अध्ययन के लिए उपयुक्त है जिसे संगठन के उच्च स्तर (यानी, ऊतक स्लाइस या जीवित जानवर में) पर विस्तारित और आगे की जांच की जा सकती है। हालांकि, एक तकनीक के रूप में सेल संवर्धन में कुछ चेतावनी हैं। मस्तिष्क के ऊतकों के अलगाव और बर्फ पर कोशिकाओं के पृथक्करण को करना और कम से कम समय में अलगाव और तैयारी के इन और बाद के चरणों को करना सबसे महत्वपूर्ण है। संदूषण एक हमेशा मौजूद बाधा है जिसे अच्छी तरह से निष्फल उपकरणों का उपयोग करके और लैमिनार हुड 37 में ऊतक पृथक्करण करने में विशेष देखभाल करके दूरकिया जा सकता है। कोशिकाओं के सही घनत्व को बीज देना भी महत्वपूर्ण है। यदि बीजित कोशिकाओं की संख्या वांछित संख्या से कम है, तो यह डिश में सेल वृद्धि और प्रसार का समर्थन नहीं करेगा। हालांकि, यदि कोशिकाएं बहुत घनी हैं, तो विकास माध्यम में पोषक तत्वों के लिए उनके बीच प्रतिस्पर्धा होगी, और इस प्रकार, अधिक कोशिका मृत्यु होगी। यही कारण है कि बीज बोने से पहले अलग कोशिकाओं की गणना करना उचित है, कम से कम शुरुआती ऊतक और पृथक्करण मात्रा के सही संबंध के बारे में कुछ अनुभव प्राप्त करने से पहले।

जीएफएपी एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला एस्ट्रोसाइट मार्कर है और अक्सर सेल संस्कृति शुद्धता38,39 का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, एस्ट्रोसाइट प्रतिक्रिया का अध्ययन करते समय केवल जीएफएपी पर्याप्त नहीं है। इसे प्रसार मार्कर जैसे कि 67 या अन्य एस्ट्रोसाइट मार्कर (ग्लूटामाइन सिंथेटेस, एल्डोलेस-सी, या एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज -1) 18,38 के साथ संयोजित करने की सलाह दी जाती है। यद्यपि ये तकनीकें शुद्ध ग्लियल सेल-प्रकार की संस्कृतियों का उत्पादन करती हैं, संस्कृति सेल शुद्धता का आकलन करने में सावधानी बरतने की आवश्यकता होती है। यह माइक्रोग्लियल सेल संस्कृतियों के लिए विशेष महत्व का है जिसमें आमतौर पर कुछ ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत या एस्ट्रोसाइट्स34 होते हैं। माइक्रोग्लियल कोशिकाओं के लिए विशिष्ट मार्कर बहुत रुचि आकर्षित करते हैं। सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला मार्कर Iba1 है, लेकिन अन्य अक्सर उपयोग किए जाने वाले मार्कर, जैसे कि विभेदन रिसेप्टर्स (CD68, CD45) और फ्रैक्टलकिन रिसेप्टर (CX3CR1), अन्य कोशिकाओं में भी पता लगाया जा सकता है (अधिक विवरण के लिए,देखें 40)। वर्तमान में, माइक्रोग्लिया के लिए सबसे विशिष्ट मार्कर TMEM119 और प्यूरीनर्जिक रिसेप्टर P2Y1241 हैं, हालांकि हाल के एक पेपर ने TMEM119 विशिष्टता42 के बारे में चिंता जताई है।

टाइमलैप्स लाइव-सेल इमेजिंग का परिचय वास्तविक समय में सीए2 + सिग्नलिंग जैसी सेलुलर प्रक्रियाओं की निगरानी का लाभ प्रदान करता है। इसके अलावा, विभिन्न रासायनिक एजेंटों (जैसे, यहां टीएचजी) को लागू करके सेल व्यवहार का मॉड्यूलेशन एक स्वस्थ सेल या सेलुलर रोग मॉडल (एचएसओडी 1जी 9 3 ए एएलएस चूहे से अलग और खेती) में सक्रिय मार्गों और सिग्नल संदेशवाहकों के विवरण के लिए और जानकारी देता है। फ्लूओ -4 एएम जैसे कोशिका झिल्ली-पारगम्य फ्लोरोसेंट रंगों के साथ काम करते समय, सेल के इंटीरियर को भरने के लिए डाई के लिए सही एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय खोजना महत्वपूर्ण है। यदि इसमें बहुत अधिक समय लगता है, तो कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखकर डाई अपटेक को बढ़ाया जा सकता है। अधिक गंभीर मामलों में, लोडिंग समाधान में हल्के डिटर्जेंट (जैसे, प्लूरोनिक एफ -127) का उपयोग किया जा सकता है। डाई की सांद्रता को 10 μM से अधिक बढ़ाकर उपरोक्त प्राप्त करने की भी सलाह नहीं दी जाती है। वास्तव में, उच्च सांद्रता पर, डाई सीए2 + बफर के रूप में कार्य कर सकती है और सीए2 + सिग्नल आयाम को कम कर सकती है।

यह भी उल्लेखनीय है कि फ्लूओ -4 और इसी तरह के एकल-तरंग दैर्ध्य रंगों के अलावा, सीए2 + - संवेदनशील अनुपातमेट्रिक रंजक (जैसे, फुरा -2) मौजूद हैं जो एक मापने पर और एक सीए2 + - असंवेदनशील संदर्भ तरंग दैर्ध्य पर उत्सर्जित होते हैं। इस प्रकार इस तरह के माप सेल में असमान डाई वितरण और ऑप्टिकल पथ में परिवर्तन के कारण पूर्वाग्रह के प्रति असंवेदनशील हैं। फिर भी, एकल-तरंग दैर्ध्य रंगों का उपयोग करना, विशेष रूप से उच्च-आत्मीयता संकेतकों जैसे कि फ्लूओ -4 के साथ, उन मामलों में उचित है जहां सापेक्ष माप एक ही नमूने के भीतर किए जाते हैं, या जहां कोई मुख्य रूप से प्रक्रिया की गतिशीलता का पालन करता है और वास्तविक सीए2 + एकाग्रता परिवर्तननहीं करता है। फिर भी, इन मापों का उपयोग सीए2 + एकाग्रता के संदर्भ में मात्रात्मक डेटा के लिए नहीं किया जा सकता है, और चित्रा 2 में प्रस्तुत डेटा से आयामों की व्याख्या करते समय सावधानी आवश्यक है।

हमने यहां दिखाया है कि जीवित कोशिकाओं-संस्कृति में एस्ट्रोसाइट्स पर इस इमेजिंग सुविधा का उपयोग करने से पैथोफिज़ियोलॉजी के सूक्ष्म इंट्रासेल्युलर तंत्र प्रकट हो सकते हैं जैसे कि सीए2 + स्टोर और स्टोर-संचालित सीए2 + प्रविष्टि की पुनःपूर्ति, जो एएलएस मॉडल में परेशान हैं, मुराइन कोशिकाओं36 पर पिछले परिणामों के अनुसार। यह तब एएलएस आईजीजी के लिए एचएसओडी 1जी 9 3 ए एस्ट्रोसाइट्स की उच्च संवेदनशीलता की व्याख्या कर सकता है, जैसा कि यहां सुझाव दिया गया है, जो पैथोलॉजी की प्रगति को शक्तिशाली बना सकता है। इस तरह के प्रयोगों में माप की तुलना करने के लिए, दृश्य के क्षेत्र में एक समान सेल घनत्व होना उचित है और यह कि आरओआई (जैसे, सोमा बनाम प्रक्रियाओं) के लिए एक ही सेल डिब्बे लिए जाते हैं।

यहां एक उदाहरण दिखाया गया था कि माइक्रोग्लियल कोशिकाओं ने एस्ट्रोसाइट्स के समान शक्ति के साथ एएलएस आईजीजी का जवाब नहीं दिया। यह एएलएस आईजीजी उपचार15 पर माइक्रोग्लियल सेल लाइन में पेरोक्साइड की दुर्लभ पीढ़ी की खोज के अनुरूप है। कुल मिलाकर, यह दृष्टिकोण एएलएस से संबंधित आईजीजी के लिए एक सेल-विशिष्ट प्रतिक्रिया की ओर इशारा करता है, माइक्रोग्लिया बनाम एस्ट्रोग्लिया के शुद्ध सेल संस्कृतियों के उपयोग के माध्यम से महसूस किया गया एक महत्वपूर्ण तथ्य भी है। न्यूरोपैथोफिज़ियोलॉजी के मॉडल से ग्लियल कोशिकाओं का उपयोग करना या रोगियों के इंड्यूसेबल प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त एएलएस जैसे गंभीर तंत्रिका रोगों में शारीरिक बायोमार्किंग का भविष्य है। इस प्रकार रोग की विशेष स्थिति के फिंगरप्रिंट के रूप में ठीक सीए2 + सिग्नलिंग को समझना या विभिन्न एक्साइटोटॉक्सिक रोगों के बीच अंतर करना आवश्यक होगा। इन उद्देश्यों के लिए, एक मशीन सीखने की प्रक्रिया विकसित करने और डेटा रिकॉर्डिंग को वर्गीकृत करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, इन कोशिकाओं को संस्कृति में उगाया जा सकता है और निदान के लिए या न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के रोगी स्तरीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में बीज दिया जा सकता है, जो न्यूरोइन्फ्लेमेशन (जैसे, सेरा, आईजीजी, सीएसएफ) के विभिन्न ह्यूमरल कारकों की प्रतिक्रिया को उजागर करने के माध्यम से किया जाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को सर्बिया के शिक्षा विज्ञान और तकनीकी विकास गणराज्य के मंत्रालय अनुबंध संख्या 451-03-9/2021-14/ 200178, FENS - NENS शिक्षा और प्रशिक्षण क्लस्टर परियोजना "न्यूरोइन्फ्लेमेशन में ग्लिया पर त्रिपक्षीय पाठ्यक्रम" और ईसी एच 2020 एमएससीए राइज अनुदान # 778405 द्वारा समर्थित किया गया था। हम इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवियों की आपूर्ति के लिए मारिजा एडजिक और मीना पेरीक और पेपर लेखन में मदद के लिए डेनिजेला बटावेलजिक को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tube Sarstedt, Germany 62 554 502
2 mL tube Sarstedt, Germany 72.691
21 G needle Nipro, Japan HN-2138-ET
23 G needle Nipro, Japan HN-2338-ET
5 mL syringe Nipro, Japan SY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslip Menzel Glasser, Germany 630-2113
60 mm Petri dish ThermoFisher Sientific, USA 130181
ATP Sigma-Aldrich, Germany A9062
AxioObserver A1 Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumine Sigma-Aldrich, Germany B6917
Calcium chloride Sigma-Aldrich, Germany 2110
Centrifuge Eppendorf, Germany
DAPI Sigma-Aldrich, Germany 10236276001
D-glucose Sigma-Aldrich, Germany 158968
DMEM Sigma-Aldrich, Germany D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody Invitrogen, USA A-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody Invitrogen, USA A-21202
EDTA Sigma-Aldrich, Germany EDS-100G
EGTA Sigma-Aldrich, Germany E4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera System Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 10500064
Fiji ImageJ Software Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM Molecular Probes, USA F14201
Goat anti-Iba1 Fujifilm Wako Chemicals, USA 011-27991
HEPES Biowest, France P5455
HighSpeed Solution Exchange System ALA Scientific Instruments, USA
Incubator Memmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chloride Sigma-Aldrich, Germany M2393
Matlab software Math Works, USA
Mouse anti-GFAP Merck Millipore, USA MAB360
Mowiol 40-88 Sigma-Aldrich, Germany 324590
Normal donkey serum Sigma-Aldrich, Germany D9663
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich, Germany 158127
Penicilin and Streptomycin ThermoFisher Sientific, USA 15140122
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich, Germany P5899
Potassium chloride Sigma-Aldrich, Germany P5405
Potassium dihydrogen phosphate Carlo Erba Reagents, Spain 471686
Shaker DELFIA PlateShake PerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Germany S3817
Sodium chloride Sigma-Aldrich, Germany S5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Carl ROTH GmbH X987.2
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich, Germany P5280
Thapsigargine Tocris Bioscience, UK 1138
Triton X - 100 Sigma-Aldrich, Germany T8787
Trypsin Sigma-Aldrich, Germany T4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator System Visitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setup Visitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lamp Ushio, Japan

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 184
चूहे एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की प्राथमिक संस्कृतियां और एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस के अध्ययन में उनका उपयोग
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Milićević, K., Korenić, A., Milošević, M., Andjus, P. R. Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (184), e63483, doi:10.3791/63483 (2022).

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