בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות
Summary
מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכניקת הדמיה עוצמתית, לא פולשנית ונטולת תוויות. יישום מתפתח אחד הוא היסטולוגיה של ראמאן, שבה הדמיית SRS בשני צבעים במעברי החלבון והשומנים ראמאן משמשת ליצירת תמונות פסאודו-המטוקסילין ואוזין. כאן אנו מדגימים פרוטוקול להדמיית SRS בשני צבעים בזמן אמת לאבחון רקמות.
Abstract
מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) התגלתה כטכניקת הדמיה אופטית רבת עוצמה לאבחון רקמות. בשנים האחרונות, הוכח כי SRS בשני צבעים מסוגל לספק תמונות שוות ערך להמטוקסילין ו-eosin (H&E) המאפשרות אבחון מהיר ואמין של סרטן המוח. יכולת כזו אפשרה יישומים מרגשים לאבחון סרטן תוך ניתוחי. הדמיית SRS בשני צבעים של רקמה יכולה להיעשות עם מקור לייזר פיקוז-שניות או פמטו-שניות. לייזרי Femtosecond נהנים מהיתרון בכך שהם מאפשרים מצבי הדמיה גמישים, כולל הדמיה היפרספקטרלית מהירה והדמיית SRS דו-צבעית בזמן אמת. גישה של מיקוד ספקטרלי עם פולסי לייזר מצייצים משמשת בדרך כלל עם לייזרים פמטו-שניות כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית גבוהה.
ניתן לממש רכישת SRS בשני צבעים באמצעות אפנון אורתוגונלי וזיהוי נעילה. המורכבות של ציוץ דופק, אפנון ואפיון היא צוואר בקבוק לאימוץ נרחב של שיטה זו. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט כדי להדגים את היישום והאופטימיזציה של SRS המתמקד בספקטרלי והדמיה בזמן אמת בשני צבעים של רקמת המוח של העכבר במצב epi-mode. פרוטוקול זה יכול לשמש למגוון רחב של יישומי הדמיית SRS הממנפים את המהירות הגבוהה ואת יכולת ההדמיה הספקטרוסקופית של SRS.
Introduction
אבחון רקמות מסורתי מסתמך על פרוטוקולי צביעה ולאחר מכן בדיקה תחת מיקרוסקופ אופטי. אחת משיטות ההכתמה הנפוצות בהן משתמשים פתולוגים היא צביעת H&E: המטוקסילין מכתים גרעיני תאים בכחול ארגמני, ואוזין מכתים את המטריצה החוץ-תאית ואת הציטופלסמה בוורוד. צביעה פשוטה זו נותרה תקן הזהב בפתולוגיה עבור משימות רבות של אבחנות רקמות, במיוחד אבחון סרטן. עם זאת, להיסטופתולוגיה של H&E, במיוחד לטכניקת החתך הקפואה המשמשת במסגרת תוך ניתוחית, עדיין יש מגבלות. הליך ההכתמה הוא תהליך מייגע הכולל הטבעת רקמות, חתך, קיבוע וכתם1. זמן ההסבה הטיפוסי הוא 20 דקות או יותר. ביצוע H&E במהלך חתך קפוא יכול לפעמים להפוך למאתגר יותר כאשר מקטעים מרובים מעובדים בבת אחת בשל הצורך להעריך תכונות תאיות או דפוסי גדילה בתלת-ממד לצורך הערכת שוליים. יתר על כן, טכניקות היסטולוגיות תוך ניתוחיות דורשות טכנאים וקלינאים מיומנים. הגבלה במספר הפתולוגים המוסמכים בבתי חולים רבים היא אילוץ להתייעצות תוך ניתוחית במקרים רבים. ניתן להקל על מגבלות כאלה עם תחומי העניין המתפתחים במהירות בפתולוגיה דיגיטלית ובאבחון מבוסס בינה מלאכותית2. עם זאת, תוצאות צביעת H&E משתנות, בהתאם לניסיון של הטכנאי, מה שמציב אתגרים נוספים לאבחון מבוסס מחשב2.
ניתן להתמודד עם אתגרים אלה באמצעות טכניקות הדמיה אופטית ללא תוויות. טכניקה אחת כזו היא מיקרוסקופיית SRS. SRS משתמש בלייזרים מסונכרנים עם פולסים – משאבה וסטוקס – כדי לעורר תנודות מולקולריות ביעילות גבוהה3. דיווחים אחרונים הראו כי הדמיית SRS של חלבונים ושומנים יכולה ליצור תמונות שוות ערך ל-H&E (הידועות גם בשם היסטולוגיה של ראמאן מגורה או SRH) עם רקמה טרייה שלמה, אשר עוקפת את הצורך בכל עיבוד רקמות, מקצרת באופן משמעותי את הזמן הדרוש לאבחון, והותאמה תוך ניתוחית4. יתר על כן, הדמיית SRS יכולה לספק תמונות תלת מימד, מה שמציע מידע נוסף לאבחון כאשר תמונות דו-ממדיות אינן מספיקות5. SRH אינו משוחד ומייצר תמונות דיגיטליות הזמינות בקלות לאבחון מבוסס מחשב. הוא מתגלה במהירות כפתרון אפשרי לאבחון סרטן תוך ניתוחי ולניתוח שולי גידול, במיוחד בסרטן המוח 6,7,8. לאחרונה, הדמיית SRS של שינויים כימיים של רקמות הוצעה גם כדי לספק מידע אבחוני שימושי שיכול לעזור עוד יותר לקלינאים לריבוד סוגי סרטן שונים או שלבים9.
למרות הפוטנציאל העצום שלה ביישומי אבחון רקמות, הדמיית SRS מוגבלת בעיקר למעבדות אקדמיות המתמחות באופטיקה בשל המורכבות הקשורה לפלטפורמת ההדמיה, הכוללת לייזרים מהירים במיוחד, מיקרוסקופ סריקת לייזר ואלקטרוניקה מתוחכמת לזיהוי. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה מפורטת להדגמת השימוש במקור לייזר femtosecond נפוץ להדמיית SRS דו-צבעית בזמן אמת וליצירת תמונות פסאודו-H&E מרקמת המוח של עכבר. הפרוטוקול יכסה את ההליכים הבאים:
יישור ואופטימיזציה של ציוץ
רוב תוכניות ההדמיה של SRS משתמשות בלייזרים פיקוז-שניות או פמטו-שניות כמקור העירור. עם לייזרים femtosecond, רוחב הפס של הלייזר הוא הרבה יותר גדול מאשר קו Raman. כדי להתגבר על מגבלה זו, נעשה שימוש בגישת מיקוד ספקטרלי כדי לצייץ את לייזרי הפמטו-שניות לציר את ציר הזמן של פיקוז-שניות כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית צרה10. רזולוציה ספקטרלית אופטימלית מושגת רק כאשר הציוץ הזמני (הידוע גם בשם פיזור השהיית הקבוצה או סתם פיזור) מותאם כראוי למשאבה וללייזרים של סטוקס. הליך היישור והצעדים הדרושים כדי לייעל את פיזור קרני הלייזר באמצעות מוטות זכוכית בעלי פיזור גבוה מודגמים כאן.
כיול תדרים
יתרון של מיקוד ספקטרלי SRS הוא שניתן לכוונן במהירות את עירור הראמן על ידי שינוי השהיית הזמן בין המשאבה ללייזרים של סטוקס. כוונון כזה מאפשר הדמיה מהירה ורכישה ספקטרלית אמינה בהשוואה לכוונון אורכי גל לייזר. עם זאת, הקשר הליניארי בין תדירות העירור לעיכוב בזמן דורש כיול חיצוני. ממיסים אורגניים עם פסגות ראמאן ידועות משמשים לכיול תדר ראמאן למיקוד ספקטרלי SRS.
הדמיה בזמן אמת, בשני צבעים
חשוב להגביר את מהירות ההדמיה ביישומי אבחון רקמות כדי לקצר את הזמן הדרוש לניתוח דגימות רקמות גדולות. הדמיית SRS דו-צבעית סימולטנית של שומנים וחלבונים מייתרת את הצורך לכוונן את הלייזר או את השהיית הזמן, מה שמגדיל את מהירות ההדמיה ביותר מפי שניים. זה מושג על ידי שימוש בטכניקת אפנון אורתוגונלית חדשנית ודמודולציה דו-ערוצית עם מגבר נעילה11. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לאפנון אורתוגונלי ולרכישת תמונה דו-ערוצית.
דימות SRS במצב אפי
רוב הדמיית ה-SRS המוצגת עד כה מבוצעת במצב שידור. הדמיה במצב אפי מזהה פוטונים מרוסקים מרקמות12. עבור יישומים פתולוגיים, דגימות כירורגיות יכול להיות גדול למדי. עבור הדמיה במצב שידור, חתך רקמות הוא לעתים קרובות הכרחי, אשר באופן בלתי רצוי דורש זמן נוסף. לעומת זאת, הדמיה במצב אפי יכולה לעבוד עם דגימות כירורגיות שלמות. מכיוון שאותה מטרה משמשת לאיסוף אור מרוסק לאחור, אין גם צורך ביישור מעבה בעל צמצם מספרי גבוה הנדרש להדמיית שידור. מצב אפי הוא גם האפשרות היחידה כאשר חיתוך רקמות קשה, כגון עם עצם. בעבר הוכחנו כי עבור רקמת המוח, הדמיה במצב אפי מציעה איכות הדמיה מעולה לעובי הרקמה > 2 מ”מ13. פרוטוקול זה משתמש במפצל קרן מקטב (PBS) כדי לאסוף פוטונים מפוזרים שעברו דה-פולריזציה על ידי רקמה. ניתן לאסוף יותר פוטונים עם גלאי טבעתי על חשבון המורכבות של הרכבה מותאמת אישית של גלאי12. גישת PBS פשוטה יותר ליישום (בדומה לפלואורסצנציה), כאשר הפוטודיודה הסטנדרטית כבר משמשת לזיהוי מצבי שידור.
יצירת תמונות פסאודו-H&E
לאחר איסוף תמונות SRS בשני צבעים, ניתן לצבוע אותן מחדש כדי לדמות את צביעת H&E. מאמר זה מדגים את הנוהל להמרת תמונות ליפידים וחלבון SRS לתמונות פסאודו-H&E SRS עבור יישומי פתולוגיה. פרוטוקול הניסוי מפרט שלבים קריטיים הדרושים ליצירת תמונות SRS באיכות גבוהה. ההליך המוצג כאן אינו ישים רק לאבחון רקמות, אלא גם יכול להיות מותאם ליישומי הדמיית SRS היפרספקטרליים רבים אחרים כגון הדמיית תרופות והדמיה מטבולית14,15.
דרישות מערכת כלליות
מערכת הלייזר של פרוטוקול זה חייבת להיות מסוגלת להפיק 2 קרני לייזר מסונכרנות של femtosecond. מערכות כוללות באופן אידיאלי מתנד פרמטרי אופטי (OPO) לכוונון אורכי גל רחבים של אחת מקרני הלייזר. ההתקנה בפרוטוקול זה משתמשת במערכת לייזר מסחרית Insight DS+ המפיקה שני לייזרים (קרן קבועה אחת ב-1,040 ננומטר וקרן אחת מבוססת OPO הניתנת לכוונון, הנעה בין 680 ל-1,300 ננומטר) עם קצב חזרה של 80 מגה-הרץ. מיקרוסקופים לסריקת לייזר, בין אם מיצרני מיקרוסקופים גדולים או שנבנו בבית, יכולים לשמש להדמיית SRS. המיקרוסקופ המנוצל הוא מיקרוסקופ סריקת לייזר זקוף הבנוי על גבי מסגרת מיקרוסקופ זקופה מסחרית. זוג מראות גלבו 5 מ”מ משמשות לסריקת קרן הלייזר. עבור משתמשים הבוחרים לאמץ מיקרוסקופ סריקת לייזר ביתי, עיין בפרוטוקול שפורסם בעבר לבניית מיקרוסקופ סריקת לייזר16.
Protocol
Representative Results
Discussion
ערכת ההדמיה של SRS בשני צבעים המוצגת בפרוטוקול זה תלויה ביישום נכון של הדמיית SRS בצבע אחד. בהדמיית SRS בצבע אחד, השלבים הקריטיים הם יישור מרחבי, יישור זמני, עומק אפנון והסטת פאזה. שילוב מרחבי של שתי הקורות נעשה על ידי מראה דיכרואית. מספר מראות היגוי משמשות להתאמה עדינה בעת שליחת הקורות למראה הד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי NIH R35 GM133435 עד D.F.
Materials
| 100 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-100-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm |
| 20 MHz bandpass filter | Minicircuits | BBP-21.4+ | Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω |
| 200 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-200-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm |
| Achromatic Half Waveplate | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | Broadband half waveplate |
| Achromatic Quarter Waveplate | Union Optic | WPA4210-650-1100-M25.4 | Broadband quarter waveplate |
| Beam Sampler | THORLABS | BSN11 | 10:90 Plate Beamsplitter |
| Dichroic Mirror | THORLABS | DMSP1000 | Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used. |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used. |
| Electrooptic Amplitude Modulator | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used. |
| False H&E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in |
| Fast Photodiode | THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Rise Time |
| Frequency Divider | PRL-220A | Pulse Research Lab | TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output. |
| Highly Dispersive Glass Rods | Union Optic | CYLROD01 | High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm |
| Insight DS+ | Newport | Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. | |
| Lock-in Amplifier | Liquid Instruments | Moku Lab | Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well. |
| Mirrors | THORLABS | BB05-E03-10 | Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used. |
| Motorized Delay Stage | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work. |
| Oil Immersion Condensor | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used. |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS7054 | Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work. |
| Phase Shifter | SigaTek | SF50A2 | For shifting the phase of the modulation frequency |
| Photodiode | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used. |
| Polarizing Beam Splitter | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Broadband polarizing beamsplitter |
| Refactive Index Database | refractiveindex.info | ||
| Retro-reflector | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used. |
| RF Power Amplifier | Minicircuits | ZHL-1-2W+ | Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω |
| Scan Mirrors | Cambridge Technologies | 6215H | We used a 5mm mirror set with silver coating |
| ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Laser scanning microscope control software |
| Shortpass Filter | THORLABS | FESH1000 | 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary. |
| Upright Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope. |
| Water Immersion Objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used. |
References
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).
- Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
- Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
- Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).
- Lu, F. -. K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. 암 연구학. 76 (12), 3451-3462 (2016).
- Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
- Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
- Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
- Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Tsai, P. S., et al., Frostig, R. D., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. , 113-171 (2002).
- Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
- He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
- Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
- Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
- Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).
