في الوقت الحقيقي ، بلونين تحفيز رامان تشتت التصوير من دماغ الفأر لتشخيص الأنسجة
Summary
يعد الفحص المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) تقنية تصوير قوية وغير مدمرة وخالية من الملصقات. أحد التطبيقات الناشئة هو تحفيز علم أنسجة رامان ، حيث يتم استخدام تصوير SRS بلونين في انتقالات رامان للبروتين والدهون لتوليد صور الهيماتوكسيلين الزائفة والإيوسين. هنا ، نوضح بروتوكولا لتصوير SRS ثنائي الألوان في الوقت الفعلي لتشخيص الأنسجة.
Abstract
ظهر الفحص المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) كتقنية تصوير بصري قوية لتشخيص الأنسجة. في السنوات الأخيرة ، ثبت أن SRS بلونين قادرين على توفير صور مكافئة للهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) تسمح بتشخيص سريع وموثوق به لسرطان الدماغ. وقد مكنت هذه القدرة من تطبيقات تشخيص السرطان المثيرة أثناء الجراحة. يمكن إجراء تصوير SRS بلونين للأنسجة إما باستخدام مصدر ليزر بيكو ثانية أو فيمتو ثانية. يتمتع ليزر الفيمتو ثانية بميزة تمكين أوضاع التصوير المرنة، بما في ذلك التصوير الطيفي السريع والتصوير SRS ثنائي الألوان في الوقت الفعلي. عادة ما يتم استخدام نهج التركيز الطيفي مع نبضات الليزر النقيقة مع ليزر الفيمتو ثانية لتحقيق دقة طيفية عالية.
يمكن تحقيق الحصول على SRS بلونين من خلال التشكيل المتعامد والكشف عن القفل. إن تعقيد النقيق النبضي والتعديل والتوصيف هو عنق الزجاجة لاعتماد هذه الطريقة على نطاق واسع. توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتوضيح تنفيذ وتحسين SRS الذي يركز على الطيف والتصوير بلونين في الوقت الفعلي لأنسجة دماغ الفأر في الوضع epi-mode. يمكن استخدام هذا البروتوكول لمجموعة واسعة من تطبيقات التصوير SRS التي تستفيد من السرعة العالية وقدرة التصوير الطيفي ل SRS.
Introduction
يعتمد تشخيص الأنسجة التقليدي على بروتوكولات التلطيخ متبوعة بالفحص تحت المجهر الضوئي. إحدى طرق التلطيخ الشائعة التي يستخدمها علماء الأمراض هي تلطيخ H & E: يلطخ الهيماتوكسيلين نوى الخلايا باللون الأزرق الأرجواني ، ويلطخ الإيوسين المصفوفة خارج الخلية والسيتوبلازم الوردي. يبقى هذا التلطيخ البسيط هو المعيار الذهبي في علم الأمراض للعديد من مهام تشخيص الأنسجة ، وخاصة تشخيص السرطان. ومع ذلك ، فإن علم الأنسجة H & E ، وخاصة تقنية التقسيم المجمدة المستخدمة في الإعداد أثناء الجراحة ، لا يزال لديه قيود. إجراء التلطيخ هو عملية شاقة تنطوي على تضمين الأنسجة ، والتقسيم ، والتثبيت ، والتلطيخ1. وقت الاستجابة النموذجي هو 20 دقيقة أو أكثر. يمكن أن يصبح أداء H & E أثناء التقسيم المجمد في بعض الأحيان أكثر تحديا عندما تتم معالجة أقسام متعددة في وقت واحد بسبب الحاجة إلى تقييم الميزات الخلوية أو أنماط النمو في 3D لتقييم الهامش. علاوة على ذلك ، تتطلب التقنيات النسيجية أثناء الجراحة فنيين وأطباء مهرة. يعد الحد من عدد أخصائيي علم الأمراض المعتمدين من مجلس الإدارة في العديد من المستشفيات عائقا أمام الاستشارة أثناء الجراحة في كثير من الحالات. يمكن تخفيف هذه القيود مع اهتمامات التطور السريع في علم الأمراض الرقمي والتشخيص القائم على الذكاء الاصطناعي2. ومع ذلك ، فإن نتائج تلطيخ H & E متغيرة ، اعتمادا على خبرة الفني ، مما يمثل تحديات إضافية للتشخيص القائم على الكمبيوتر2.
ويمكن معالجة هذه التحديات باستخدام تقنيات التصوير البصري الخالية من الملصقات. واحدة من هذه التقنيات هي المجهر SRS. يستخدم SRS أشعة الليزر النبضية المتزامنة – المضخة و Stokes – لإثارة الاهتزازات الجزيئية بكفاءة عالية3. أظهرت التقارير الأخيرة أن تصوير SRS للبروتينات والدهون يمكن أن يولد صورا مكافئة ل H & E (المعروف أيضا باسم أنسجة رامان المحفزة أو SRH) مع أنسجة طازجة سليمة ، والتي تتجاوز الحاجة إلى أي معالجة للأنسجة ، وتقصر بشكل كبير الوقت اللازم للتشخيص ، وقد تم تكييفها أثناء الجراحة4. علاوة على ذلك ، يمكن أن يوفر تصوير SRS صورا ثلاثية الأبعاد ، والتي توفر معلومات إضافية للتشخيص عندما تكون الصور ثنائية الأبعاد غير كافية5. SRH غير متحيز ويولد صورا رقمية متاحة بسهولة للتشخيص القائم على الكمبيوتر. سرعان ما يظهر كحل ممكن لتشخيص السرطان أثناء الجراحة وتحليل هامش الورم ، خاصة في سرطان الدماغ6،7،8. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح تصوير SRS للتغيرات الكيميائية للأنسجة لتوفير معلومات تشخيصية مفيدة يمكن أن تساعد الأطباء على تقسيم أنواع السرطان المختلفة أو المراحل9 إلى طبقات.
على الرغم من إمكاناته الهائلة في تطبيقات تشخيص الأنسجة ، إلا أن تصوير SRS يقتصر في الغالب على المختبرات الأكاديمية المتخصصة في البصريات بسبب التعقيد المرتبط بمنصة التصوير ، والتي تشمل أشعة الليزر فائقة السرعة ، والمجهر الضوئي بالليزر ، وإلكترونيات الكشف المتطورة. يوفر هذا البروتوكول سير عمل مفصلا لإثبات استخدام مصدر ليزر فيمتو ثانية شائع لتصوير SRS ثنائي اللون في الوقت الفعلي وتوليد صور H&E الزائفة من أنسجة دماغ الماوس. وسيغطي البروتوكول الإجراءات التالية:
المحاذاة وتحسين النقيق
تستخدم معظم مخططات التصوير SRS إما ليزر بيكو ثانية أو فيمتو ثانية كمصدر للإثارة. مع ليزر الفيمتو ثانية ، يكون عرض النطاق الترددي لليزر أكبر بكثير من عرض خط رامان. للتغلب على هذا القيد، يتم استخدام نهج التركيز الطيفي لدق ليزر الفيمتو ثانية إلى مقياس زمني بيكو ثانية لتحقيق دقة طيفية ضيقة10. يتم تحقيق الدقة الطيفية المثلى فقط عندما يتم مطابقة النقيق الزمني (المعروف أيضا باسم تشتت تأخير المجموعة أو مجرد تشتت) بشكل صحيح للمضخة وليزر ستوكس. يتم عرض إجراء المحاذاة والخطوات اللازمة لتحسين تشتت أشعة الليزر باستخدام قضبان زجاجية عالية التشتت هنا.
معايرة التردد
ميزة التركيز الطيفي SRS هي أنه يمكن ضبط إثارة رامان بسرعة عن طريق تغيير التأخير الزمني بين المضخة وليزر ستوكس. يوفر هذا الضبط تصويرا سريعا واكتساب طيفيا موثوقا به مقارنة بضبط الأطوال الموجية لليزر. ومع ذلك ، فإن العلاقة الخطية بين تردد الإثارة والتأخير الزمني تتطلب معايرة خارجية. تستخدم المذيبات العضوية ذات قمم رامان المعروفة لمعايرة تردد رامان للتركيز الطيفي SRS.
تصوير بلونين في الوقت الفعلي
من المهم زيادة سرعة التصوير في تطبيقات تشخيص الأنسجة لتقصير الوقت اللازم لتحليل عينات الأنسجة الكبيرة. يغني التصوير المتزامن ثنائي اللون للدهون والبروتينات عن الحاجة إلى ضبط الليزر أو تأخير الوقت ، مما يزيد من سرعة التصوير بأكثر من الضعفين. ويتحقق ذلك باستخدام تقنية تعديل متعامدة جديدة وإزالة الدمود ثنائية القناة مع مضخم صوت القفل11. تصف هذه الورقة بروتوكول التشكيل المتعامد والحصول على صورة مزدوجة القناة.
التصوير SRS في وضع epi
يتم إجراء غالبية تصوير SRS المعروض حتى الآن في وضع الإرسال. يكتشف التصوير في الوضع Epi-mode الفوتونات المتناثرة من الأنسجة12. بالنسبة لتطبيقات علم الأمراض ، يمكن أن تكون العينات الجراحية كبيرة جدا. بالنسبة لتصوير وضع الإرسال ، غالبا ما يكون تقسيم الأنسجة ضروريا ، وهو ما يتطلب وقتا إضافيا بشكل غير مرغوب فيه. في المقابل ، يمكن أن يعمل التصوير في وضع epi مع عينات جراحية سليمة. ونظرا لأن الهدف نفسه يستخدم لجمع الضوء المتناثر عكسيا، فليست هناك حاجة أيضا إلى محاذاة مكثف ذي فتحة رقمية عالية مطلوب لتصوير الإرسال. وضع Epi-mode هو أيضا الخيار الوحيد عندما يكون تقسيم الأنسجة صعبا ، كما هو الحال مع العظام. لقد أثبتنا سابقا أنه بالنسبة لأنسجة المخ ، يوفر التصوير في وضع epi-mode جودة تصوير فائقة لسمك الأنسجة > 2 مم13. يستخدم هذا البروتوكول مقسم شعاع الاستقطاب (PBS) لجمع الفوتونات المتناثرة غير المستقطبة بواسطة الأنسجة. من الممكن جمع المزيد من الفوتونات باستخدام كاشف حلقي على حساب تعقيد تجميع الكاشف المخصص12. نهج PBS أبسط في التنفيذ (على غرار التألق) ، مع استخدام الصمام الثنائي الضوئي القياسي بالفعل للكشف عن وضع الإرسال.
توليد صور Pseudo-H&E
بمجرد جمع صور SRS بلونين ، يمكن إعادة تلوينها لمحاكاة تلطيخ H & E. توضح هذه الورقة الإجراء الخاص بتحويل صور SRS للدهون والبروتين إلى صور زائفة H & E SRS لتطبيقات علم الأمراض. يفصل البروتوكول التجريبي الخطوات الحاسمة اللازمة لإنشاء صور SRS عالية الجودة. الإجراء الموضح هنا لا ينطبق فقط على تشخيص الأنسجة ولكن أيضا يمكن تكييفه للعديد من تطبيقات التصوير SRS الفائقة الطيف الأخرى مثل التصوير الدوائي والتصوير الأيضي14,15.
متطلبات النظام العامة
يجب أن يكون نظام الليزر لهذا البروتوكول قادرا على إخراج 2 أشعة ليزر الفيمتو ثانية متزامنة. تتميز الأنظمة بشكل مثالي بمذبذب بصري بارامتري (OPO) لضبط الطول الموجي العريض لأحد حزم الليزر. يستخدم الإعداد في هذا البروتوكول نظام ليزر تجاري Insight DS+ ينتج ليزرين (شعاع ثابت واحد عند 1040 نانومتر وشعاع قابل للضبط قائم على OPO ، يتراوح من 680 إلى 1300 نانومتر) بمعدل تكرار يبلغ 80 ميجاهرتز. يمكن استخدام المجاهر الماسحة الضوئية بالليزر ، إما من كبرى الشركات المصنعة للمجهر أو المبنية في المنزل ، لتصوير SRS. المجهر المستخدم هو مجهر مسح بالليزر المستقيم مبني فوق إطار مجهر تجاري مستقيم. يتم استخدام زوج من مرايا galvo 5 مم لمسح شعاع الليزر. بالنسبة للمستخدمين الذين يختارون اعتماد مجهر مسح بالليزر محلي الصنع ، راجع بروتوكولا منشورا مسبقا لبناء مجهر مسح بالليزر16.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتمد نظام التصوير SRS ثنائي اللون المقدم في هذا البروتوكول على التنفيذ السليم لتصوير SRS بلون واحد. في تصوير SRS بلون واحد ، تتمثل الخطوات الحاسمة في المحاذاة المكانية والمحاذاة الزمنية وعمق التشكيل وتحول الطور. يتم إنجاز الجمع بين الحزمتين مكانيا بواسطة مرآة ثنائية اللون. يتم استخدام العدي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل NIH R35 GM133435 إلى D.F.
Materials
| 100 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-100-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm |
| 20 MHz bandpass filter | Minicircuits | BBP-21.4+ | Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω |
| 200 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-200-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm |
| Achromatic Half Waveplate | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | Broadband half waveplate |
| Achromatic Quarter Waveplate | Union Optic | WPA4210-650-1100-M25.4 | Broadband quarter waveplate |
| Beam Sampler | THORLABS | BSN11 | 10:90 Plate Beamsplitter |
| Dichroic Mirror | THORLABS | DMSP1000 | Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used. |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used. |
| Electrooptic Amplitude Modulator | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used. |
| False H&E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in |
| Fast Photodiode | THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Rise Time |
| Frequency Divider | PRL-220A | Pulse Research Lab | TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output. |
| Highly Dispersive Glass Rods | Union Optic | CYLROD01 | High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm |
| Insight DS+ | Newport | Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. | |
| Lock-in Amplifier | Liquid Instruments | Moku Lab | Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well. |
| Mirrors | THORLABS | BB05-E03-10 | Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used. |
| Motorized Delay Stage | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work. |
| Oil Immersion Condensor | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used. |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS7054 | Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work. |
| Phase Shifter | SigaTek | SF50A2 | For shifting the phase of the modulation frequency |
| Photodiode | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used. |
| Polarizing Beam Splitter | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Broadband polarizing beamsplitter |
| Refactive Index Database | refractiveindex.info | ||
| Retro-reflector | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used. |
| RF Power Amplifier | Minicircuits | ZHL-1-2W+ | Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω |
| Scan Mirrors | Cambridge Technologies | 6215H | We used a 5mm mirror set with silver coating |
| ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Laser scanning microscope control software |
| Shortpass Filter | THORLABS | FESH1000 | 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary. |
| Upright Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope. |
| Water Immersion Objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used. |
References
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).
- Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
- Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
- Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).
- Lu, F. -. K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. 암 연구학. 76 (12), 3451-3462 (2016).
- Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
- Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
- Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
- Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Tsai, P. S., et al., Frostig, R. D., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. , 113-171 (2002).
- Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
- He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
- Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
- Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
- Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).
