Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is een krachtige, niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechniek. Een opkomende toepassing is gestimuleerde Raman-histologie, waarbij tweekleurige SRS-beeldvorming bij de eiwit- en lipide Raman-overgangen wordt gebruikt om pseudo-hematoxyline- en eosinebeelden te genereren. Hier demonstreren we een protocol voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming voor weefseldiagnose.
Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is naar voren gekomen als een krachtige optische beeldvormingstechniek voor weefseldiagnose. In de afgelopen jaren is aangetoond dat tweekleurige SRS in staat is om hematoxyline- en eosine (H & E) -equivalente beelden te leveren die een snelle en betrouwbare diagnose van hersenkanker mogelijk maken. Een dergelijk vermogen heeft spannende intraoperatieve kankerdiagnosetoepassingen mogelijk gemaakt. Tweekleurige SRS-beeldvorming van weefsel kan worden gedaan met een picoseconde of femtoseconde laserbron. Femtoseconde lasers hebben het voordeel dat ze flexibele beeldvormingsmodi mogelijk maken, waaronder snelle hyperspectrale beeldvorming en real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming. Een spectraal-focusbenadering met getjilpte laserpulsen wordt meestal gebruikt met femtosecondelasers om een hoge spectrale resolutie te bereiken.
Tweekleurige SRS-acquisitie kan worden gerealiseerd met orthogonale modulatie en lock-in detectie. De complexiteit van pulsgefluit, modulatie en karakterisering is een knelpunt voor de wijdverspreide toepassing van deze methode. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om de implementatie en optimalisatie van spectraal-gerichte SRS en real-time, tweekleurige beeldvorming van hersenweefsel van muizen in de epi-modus te demonstreren. Dit protocol kan worden gebruikt voor een breed scala aan SRS-beeldvormingstoepassingen die gebruikmaken van de hoge snelheid en spectroscopische beeldvormingsmogelijkheden van SRS.
Traditionele weefseldiagnostiek is gebaseerd op kleuringsprotocollen gevolgd door onderzoek onder een optische microscoop. Een veel voorkomende kleuringsmethode die door pathologen wordt gebruikt, is H & E-kleuring: hematoxyline kleurt celkernen een paarsblauw en eosine kleurt de extracellulaire matrix en cytoplasma roze. Deze eenvoudige kleuring blijft de gouden standaard in de pathologie voor veel weefseldiagnosetaken, met name kankerdiagnose. H&E-histopathologie, met name de bevroren sectietechniek die wordt gebruikt in een intraoperatieve setting, heeft echter nog steeds beperkingen. De kleuringsprocedure is een moeizaam proces waarbij weefsel wordt ingesloten, sectie, fixatie en kleuring1. De typische doorlooptijd is 20 minuten of langer. Het uitvoeren van H & E tijdens bevroren secties kan soms een grotere uitdaging worden wanneer meerdere secties tegelijk worden verwerkt vanwege de noodzaak om cellulaire kenmerken of groeipatronen in 3D te evalueren voor margebeoordeling. Bovendien vereisen intraoperatieve histologische technieken bekwame technici en clinici. Beperking van het aantal door de raad gecertificeerde pathologen in veel ziekenhuizen is in veel gevallen een beperking voor intraoperatief overleg. Dergelijke beperkingen kunnen worden verlicht met de snelle ontwikkelingsinteresses in digitale pathologie en op kunstmatige intelligentie gebaseerde diagnose2. De H&E-kleuringsresultaten zijn echter variabel, afhankelijk van de ervaring van de technicus, wat extra uitdagingen oplevert voor computergebaseerde diagnose2.
Deze uitdagingen kunnen mogelijk worden aangepakt met labelvrije optische beeldvormingstechnieken. Een van die technieken is SRS-microscopie. SRS maakt gebruik van gesynchroniseerde gepulseerde lasers – pomp en Stokes – om moleculaire trillingen met een hoog rendement te prikkelen3. Recente rapporten hebben aangetoond dat SRS-beeldvorming van eiwitten en lipiden H & E-equivalente beelden kan genereren (ook bekend als gestimuleerde Raman-histologie of SRH) met intact vers weefsel, wat de noodzaak van weefselverwerking omzeilt, de tijd die nodig is voor diagnose aanzienlijk verkort en intraoperatief is aangepast4. Bovendien kan SRS-beeldvorming 3D-beelden leveren, wat extra informatie biedt voor diagnose wanneer 2D-beelden onvoldoende zijn5. SRH is onbevooroordeeld en genereert digitale beelden die direct beschikbaar zijn voor computergebaseerde diagnose. Het komt snel naar voren als een mogelijke oplossing voor intraoperatieve kankerdiagnose en tumormargeanalyse, vooral bij hersenkanker 6,7,8. Meer recent is SRS-beeldvorming van chemische veranderingen van weefsel ook voorgesteld om nuttige diagnostische informatie te bieden die clinici verder kan helpen bij het stratificeren van verschillende soorten kanker of stadia9.
Ondanks het enorme potentieel in weefseldiagnosetoepassingen, is SRS-beeldvorming meestal beperkt tot academische laboratoria die gespecialiseerd zijn in optica vanwege de complexiteit die gepaard gaat met het beeldvormingsplatform, dat ultrasnelle lasers, de laserscanmicroscoop en geavanceerde detectie-elektronica omvat. Dit protocol biedt een gedetailleerde workflow om het gebruik van een gemeenschappelijke femtoseconde laserbron voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming en het genereren van pseudo-H & E-beelden van hersenweefsel van muizen te demonstreren. Het protocol heeft betrekking op de volgende procedures:
Optimalisatie van uitlijning en tjirp
De meeste SRS-beeldvormingsschema’s gebruiken picoseconde- of femtosecondelasers als excitatiebron. Bij femtoseconde lasers is de bandbreedte van de laser veel groter dan de Raman lijnbreedte. Om deze beperking te overwinnen, wordt een spectrale focusbenadering gebruikt om de femtosecondelasers naar een picoseconde tijdschaal te tsjilpen om een smalle spectrale resolutie10 te bereiken. Optimale spectrale resolutie wordt alleen bereikt wanneer het temporele getjilp (ook bekend als de groepsvertragingsdispersie of gewoon dispersie) goed is afgestemd op de pomp en de Stokes-lasers. De uitlijningsprocedure en de stappen die nodig zijn om de dispersie van de laserstralen te optimaliseren met behulp van zeer dispersieve glazen staven worden hier gedemonstreerd.
Frequentie kalibratie
Een voordeel van spectraal focus SRS is dat de Raman excitatie snel kan worden afgestemd door de tijdsvertraging tussen de pomp en de Stokes lasers te veranderen. Een dergelijke afstemming biedt snelle beeldvorming en betrouwbare spectrale acquisitie in vergelijking met het afstemmen van lasergolflengten. De lineaire relatie tussen excitatiefrequentie en tijdvertraging vereist echter externe kalibratie. Organische oplosmiddelen met bekende Raman-pieken worden gebruikt om de Raman-frequentie te kalibreren voor spectraalfocusSRS.
Real-time, tweekleurenbeeldvorming
Het is belangrijk om de beeldvormingssnelheid in weefseldiagnosetoepassingen te verhogen om de tijd te verkorten die nodig is voor het analyseren van grote weefselmonsters. Gelijktijdige tweekleurige SRS-beeldvorming van lipiden en eiwitten voorkomt de noodzaak om de laser of tijdvertraging af te stemmen, waardoor de beeldvormingssnelheid meer dan twee keer toeneemt. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een nieuwe orthogonale modulatietechniek en tweekanaals demodulatie met een lock-in versterker11. Dit artikel beschrijft het protocol voor orthogonale modulatie en dual-channel beeldacquisitie.
Epi-mode SRS-beeldvorming
De meeste SRS-beeldvorming die tot nu toe is getoond, wordt uitgevoerd in transmissiemodus. Epi-mode beeldvorming detecteert backscattered fotonen uit weefsel12. Voor pathologietoepassingen kunnen chirurgische monsters vrij groot zijn. Voor beeldvorming in transmissiemodus is vaak weefselsectie nodig, wat ongewenst extra tijd vereist. Epi-modus beeldvorming kan daarentegen werken met intacte chirurgische monsters. Omdat hetzelfde objectief wordt gebruikt om teruggekaatst licht te verzamelen, is het ook niet nodig om een condensor met een hoog numeriek diafragma uit te lijnen die nodig is voor transmissiebeeldvorming. Epi-modus is ook de enige optie wanneer weefselsectie moeilijk is, zoals bij bot. Eerder hebben we aangetoond dat voor hersenweefsel epi-mode beeldvorming superieure beeldvormingskwaliteit biedt voor weefseldikte > 2 mm13. Dit protocol maakt gebruik van een polariserende bundelsplitser (PBS) om verstrooide fotonen te verzamelen die door weefsel zijn gedepolariseerd. Het is mogelijk om meer fotonen te verzamelen met een ringvormige detector ten koste van de complexiteit van aangepaste detectorassemblage12. De PBS-aanpak is eenvoudiger te implementeren (vergelijkbaar met fluorescentie), waarbij de standaard fotodiode al wordt gebruikt voor detectie van transmissiemodi.
Pseudo-H&E-beeldgeneratie
Zodra tweekleurige SRS-afbeeldingen zijn verzameld, kunnen ze opnieuw worden ingekleurd om H & E-kleuring te simuleren. Dit artikel demonstreert de procedure voor het converteren van lipide- en eiwit-SRS-afbeeldingen naar pseudo-H & E SRS-beelden voor pathologietoepassingen. Het experimentele protocol beschrijft kritieke stappen die nodig zijn om SRS-beelden van hoge kwaliteit te genereren. De hier getoonde procedure is niet alleen van toepassing op weefseldiagnose, maar kan ook worden aangepast voor vele andere hyperspectrale SRS-beeldvormingstoepassingen zoals beeldvorming van geneesmiddelen en metabole beeldvorming14,15.
Algemene systeemvereisten
Het lasersysteem voor dit protocol moet 2 gesynchroniseerde femtoseconde laserstralen kunnen produceren. Systemen zijn idealiter voorzien van een Optische Parametrische Oscillator (OPO) voor brede golflengteafstemming van een van de laserstralen. De opstelling in dit protocol maakt gebruik van een commercieel lasersysteem Insight DS + dat twee lasers uitvoert (een vaste straal bij 1.040 nm en een op OPO gebaseerde afstembare straal, variërend van 680 tot 1.300 nm) met een herhalingsfrequentie van 80 MHz. Laserscanmicroscopen, hetzij van grote microscoopfabrikanten of zelfgebouwd, kunnen worden gebruikt voor SRS-beeldvorming. De gebruikte microscoop is een rechtopstaande laserscanmicroscoop gebouwd bovenop een commercieel rechtopstaand microscoopframe. Een paar 5 mm galvo spiegels worden gebruikt om de laserstraal te scannen. Voor gebruikers die ervoor kiezen om een zelfgebouwde laserscanmicroscoop te gebruiken, raadpleegt u een eerder gepubliceerd protocol voor de constructie van een laserscanmicroscoop16.
Het tweekleurige SRS-beeldvormingsschema dat in dit protocol wordt gepresenteerd, hangt af van de juiste implementatie van SRS-beeldvorming met één kleur. In SRS-beeldvorming met één kleur zijn de kritieke stappen ruimtelijke uitlijning, temporele uitlijning, modulatiediepte en faseverschuiving. Ruimtelijk combineren van de twee balken wordt bereikt door een dichroïsche spiegel. Verschillende stuurspiegels worden gebruikt voor fijnafstelling bij het verzenden van de balken naar de dichroïsche spiegel. Zodra de balk…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door NIH R35 GM133435 tot D.F.
100 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-100-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm |
20 MHz bandpass filter | Minicircuits | BBP-21.4+ | Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω |
200 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-200-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm |
Achromatic Half Waveplate | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | Broadband half waveplate |
Achromatic Quarter Waveplate | Union Optic | WPA4210-650-1100-M25.4 | Broadband quarter waveplate |
Beam Sampler | THORLABS | BSN11 | 10:90 Plate Beamsplitter |
Dichroic Mirror | THORLABS | DMSP1000 | Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used. |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used. |
Electrooptic Amplitude Modulator | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used. |
False H&E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in |
Fast Photodiode | THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Rise Time |
Frequency Divider | PRL-220A | Pulse Research Lab | TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output. |
Highly Dispersive Glass Rods | Union Optic | CYLROD01 | High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm |
Insight DS+ | Newport | Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. | |
Lock-in Amplifier | Liquid Instruments | Moku Lab | Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well. |
Mirrors | THORLABS | BB05-E03-10 | Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used. |
Motorized Delay Stage | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work. |
Oil Immersion Condensor | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used. |
Oscilloscope | Tektronix | TDS7054 | Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work. |
Phase Shifter | SigaTek | SF50A2 | For shifting the phase of the modulation frequency |
Photodiode | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used. |
Polarizing Beam Splitter | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Broadband polarizing beamsplitter |
Refactive Index Database | refractiveindex.info | ||
Retro-reflector | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used. |
RF Power Amplifier | Minicircuits | ZHL-1-2W+ | Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω |
Scan Mirrors | Cambridge Technologies | 6215H | We used a 5mm mirror set with silver coating |
ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Laser scanning microscope control software |
Shortpass Filter | THORLABS | FESH1000 | 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary. |
Upright Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope. |
Water Immersion Objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used. |