Echtzeit-, zweifarbige stimulierte Raman-Streubildgebung des Mausgehirns für die Gewebediagnose

Summary

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ist eine leistungsstarke, zerstörungsfreie und markierungsfreie Bildgebungstechnik. Eine aufkommende Anwendung ist die stimulierte Raman-Histologie, bei der die zweifarbige SRS-Bildgebung an den Protein- und Lipid-Raman-Übergängen verwendet wird, um Pseudo-Hämatoxylin- und Eosin-Bilder zu erzeugen. Hier demonstrieren wir ein Protokoll für die zweifarbige SRS-Bildgebung in Echtzeit für die Gewebediagnose.

Abstract

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) hat sich zu einem leistungsstarken optischen Bildgebungsverfahren für die Gewebediagnose entwickelt. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass zweifarbiges SRS in der Lage ist, Hämatoxylin und Eosin (H & E) -äquivalente Bilder zu liefern, die eine schnelle und zuverlässige Diagnose von Hirntumoren ermöglichen. Diese Fähigkeit hat aufregende intraoperative Krebsdiagnoseanwendungen ermöglicht. Die zweifarbige SRS-Bildgebung von Gewebe kann entweder mit einer Pikosekunden- oder Femtosekunden-Laserquelle durchgeführt werden. Femtosekundenlaser haben den Vorteil, dass sie flexible Bildgebungsmodi ermöglichen, einschließlich schneller hyperspektraler Bildgebung und zweifarbiger SRS-Bildgebung in Echtzeit. Ein spektraler Fokussierungsansatz mit chirped Laserpulsen wird typischerweise mit Femtosekundenlasern verwendet, um eine hohe spektrale Auflösung zu erreichen.

Die Zwei-Farben-SRS-Erfassung kann mit orthogonaler Modulation und Lock-in-Erkennung realisiert werden. Die Komplexität des Pulschirpens, der Modulation und der Charakterisierung ist ein Engpass für die weit verbreitete Einführung dieser Methode. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll, um die Implementierung und Optimierung von spektral fokussierendem SRS und der zweifarbigen Echtzeitbildgebung von Hirngewebe der Maus im Epi-Modus zu demonstrieren. Dieses Protokoll kann für eine breite Palette von SRS-Bildgebungsanwendungen verwendet werden, die die Hochgeschwindigkeits- und spektroskopische Bildgebungsfähigkeit von SRS nutzen.

Introduction

Die traditionelle Gewebediagnostik stützt sich auf Färbeprotokolle, gefolgt von einer Untersuchung unter einem optischen Mikroskop. Eine gängige Färbemethode, die von Pathologen verwendet wird, ist die H & E-Färbung: Hämatoxylin färbt Zellkerne in einem violetten Blau und Eosin färbt die extrazelluläre Matrix und das Zytoplasma rosa. Diese einfache Färbung bleibt der Goldstandard in der Pathologie für viele Aufgaben der Gewebediagnose, insbesondere für die Krebsdiagnose. Die H & E-Histopathologie, insbesondere die gefrorene Schnitttechnik, die in einer intraoperativen Umgebung verwendet wird, hat jedoch immer noch Einschränkungen. Das Färbeverfahren ist ein mühsamer Prozess, bei dem Gewebe eingebettet, geschnitten, fixiert und gefärbt^{wird 1}. Die typische Bearbeitungszeit beträgt 20 Minuten oder länger. Die Durchführung von H&E während des gefrorenen Abschnitts kann manchmal schwieriger werden, wenn mehrere Abschnitte gleichzeitig verarbeitet werden, da zelluläre Merkmale oder Wachstumsmuster in 3D zur Margenbewertung bewertet werden müssen. Darüber hinaus erfordern intraoperative histologische Techniken qualifizierte Techniker und Kliniker. Die Begrenzung der Anzahl der Board-zertifizierten Pathologen in vielen Krankenhäusern ist in vielen Fällen eine Einschränkung für die intraoperative Konsultation. Solche Einschränkungen können durch die schnellen Entwicklungsinteressen in der digitalen Pathologie und der auf künstlicher Intelligenz basierenden Diagnose^{gemildert werden 2}. Die H&E-Färbeergebnisse sind jedoch je nach Erfahrung des Technikers variabel, was zusätzliche Herausforderungen für die computergestützte Diagnose^{darstellt 2}.

Diese Herausforderungen können potenziell mit markierungsfreien optischen Bildgebungsverfahren angegangen werden. Eine solche Technik ist die SRS-Mikroskopie. SRS verwendet synchronisierte gepulste Laser – Pumpe und Stokes – um molekulare Schwingungen mit hoher Effizienz^{anzuregen 3}. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass die SRS-Bildgebung von Proteinen und Lipiden H & E-äquivalente Bilder (auch bekannt als stimulierte Raman-Histologie oder SRH) mit intaktem frischem Gewebe erzeugen kann, was die Notwendigkeit einer Gewebeverarbeitung umgeht, die für die Diagnose erforderliche Zeit signifikant verkürzt und intraoperativ angepasst^{wurde 4}. Darüber hinaus kann die SRS-Bildgebung 3D-Bilder liefern, was zusätzliche Informationen für die Diagnose bietet, wenn 2D-Bilder unzureichend sind⁵. SRH ist unvoreingenommen und generiert digitale Bilder, die für die computergestützte Diagnose leicht verfügbar sind. Es stellt sich schnell als mögliche Lösung für die intraoperative Krebsdiagnose und Tumorrandanalyse heraus, insbesondere bei Hirntumoren ^6,7,8. In jüngerer Zeit wurde auch vorgeschlagen, dass die SRS-Bildgebung chemischer Veränderungen des Gewebes nützliche diagnostische Informationen liefert, die Klinikern bei der Stratifizierung verschiedener Krebsarten oder -stadien⁹ helfen können.

Trotz ihres enormen Potenzials in der Gewebediagnose ist die SRS-Bildgebung aufgrund der Komplexität, die mit der Bildgebungsplattform verbunden ist, die ultraschnelle Laser, das Laserscanning-Mikroskop und anspruchsvolle Detektionselektronik umfasst, meist auf akademische Labors beschränkt, die auf Optik spezialisiert sind. Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Workflow, um die Verwendung einer gemeinsamen Femtosekunden-Laserquelle für die zweifarbige Echtzeit-SRS-Bildgebung und die Erzeugung von Pseudo-H & E-Bildern aus dem Hirngewebe der Maus zu demonstrieren. Das Protokoll deckt die folgenden Verfahren ab:

Ausrichtungs- und Chirp-Optimierung
Die meisten SRS-Bildgebungsschemata verwenden entweder Pikosekunden- oder Femtosekundenlaser als Anregungsquelle. Bei Femtosekundenlasern ist die Bandbreite des Lasers viel größer als die Raman-Linienbreite. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird ein spektraler Fokussierungsansatz verwendet, um die Femtosekundenlaser auf eine Pikosekunden-Zeitskala zu chirpen, um eine enge spektrale Auflösung¹⁰ zu erreichen. Eine optimale spektrale Auflösung wird nur erreicht, wenn das zeitliche Zwitschern (auch bekannt als Gruppenverzögerungsdispersion oder nur Dispersion) für die Pumpe und die Stokes-Laser richtig abgestimmt ist. Hier werden das Ausrichtungsverfahren und die notwendigen Schritte zur Optimierung der Dispergierung der Laserstrahlen mit hochdispersiven Glasstäben demonstriert.

Frequenzkalibrierung
Ein Vorteil der spektralen Fokussierung SRS besteht darin, dass die Raman-Anregung schnell abgestimmt werden kann, indem die Zeitverzögerung zwischen der Pumpe und den Stokes-Lasern geändert wird. Eine solche Abstimmung ermöglicht eine schnelle Bildgebung und zuverlässige spektrale Erfassung im Vergleich zur Abstimmung von Laserwellenlängen. Die lineare Beziehung zwischen Anregungsfrequenz und Zeitverzögerung erfordert jedoch eine externe Kalibrierung. Organische Lösungsmittel mit bekannten Raman-Peaks werden verwendet, um die Raman-Frequenz für die spektrale Fokussierung von SRS zu kalibrieren.

Zweifarbige Echtzeit-Bildgebung
Es ist wichtig, die Bildgebungsgeschwindigkeit in Gewebediagnoseanwendungen zu erhöhen, um die Zeit für die Analyse großer Gewebeproben zu verkürzen. Durch die gleichzeitige zweifarbige SRS-Bildgebung von Lipiden und Proteinen entfällt die Notwendigkeit, den Laser oder die Zeitverzögerung abzustimmen, was die Bildgebungsgeschwindigkeit um mehr als das Doppelte erhöht. Dies wird durch die Verwendung einer neuartigen orthogonalen Modulationstechnik und einer zweikanaligen Demodulation mit einem Lock-in-Verstärker¹¹ erreicht. Dieses Papier beschreibt das Protokoll für orthogonale Modulation und zweikanalige Bildaufnahme.

Epi-Mode-SRS-Bildgebung
Der Großteil der bisher gezeigten SRS-Bildgebung wird im Übertragungsmodus durchgeführt. Die Epimode-Bildgebung erkennt rückgestreute Photonen aus Gewebe¹². Für pathologische Anwendungen können chirurgische Proben ziemlich groß sein. Für die Bildgebung im Übertragungsmodus ist häufig eine Gewebeschnittaufnahme erforderlich, die unerwünschterweise zusätzliche Zeit in Anspruch nimmt. Im Gegensatz dazu kann die Epimode-Bildgebung mit intakten chirurgischen Proben arbeiten. Da das gleiche Ziel verwendet wird, um rückgestreutes Licht zu sammeln, ist es auch nicht erforderlich, einen Kondensator mit hoher numerischer Apertur, der für die Transmissionsbildgebung erforderlich ist, auszurichten. Der Epi-Modus ist auch die einzige Option, wenn der Gewebeschnitt schwierig ist, z. B. bei Knochen. Zuvor haben wir gezeigt, dass die Epimode-Bildgebung für Hirngewebe eine überlegene Bildgebungsqualität für die Gewebedicke > 2 mm¹³ bietet. Dieses Protokoll verwendet einen polarisierenden Strahlteiler (PBS), um gestreute Photonen zu sammeln, die durch Gewebe depolarisiert sind. Es ist möglich, mehr Photonen mit einem ringförmigen Detektor auf Kosten der Komplexität der kundenspezifischen Detektorbaugruppe^{zu sammeln 12}. Der PBS-Ansatz ist einfacher zu implementieren (ähnlich wie bei der Fluoreszenz), wobei die Standard-Fotodiode bereits für die Transmissionsmodusdetektion verwendet wird.

Pseudo-H&E-Bildgenerierung
Sobald zweifarbige SRS-Bilder gesammelt wurden, können sie neu eingefärbt werden, um H & E-Färbungen zu simulieren. Dieses Papier demonstriert das Verfahren zur Umwandlung von Lipid- und Protein-SRS-Bildern in Pseudo-H & E SRS-Bilder für pathologische Anwendungen. Das experimentelle Protokoll beschreibt kritische Schritte, die erforderlich sind, um qualitativ hochwertige SRS-Bilder zu erzeugen. Das hier gezeigte Verfahren ist nicht nur für die Gewebediagnostik anwendbar, sondern kann auch für viele andere hyperspektrale SRS-Bildgebungsanwendungen wie Arzneimittelbildgebung und metabolische Bildgebung^{angepasst werden 14,15}.

Allgemeine Systemanforderungen
Das Lasersystem für dieses Protokoll muss in der Lage sein, 2 synchronisierte Femtosekunden-Laserstrahlen auszugeben. Die Systeme verfügen idealerweise über einen optischen parametrischen Oszillator (OPO) zur Breitwellenlängenabstimmung eines der Laserstrahlen. Der Aufbau in diesem Protokoll verwendet ein kommerzielles Lasersystem Insight DS+, das zwei Laser (einen festen Strahl bei 1.040 nm und einen OPO-basierten abstimmbaren Strahl im Bereich von 680 bis 1.300 nm) mit einer Wiederholrate von 80 MHz ausgibt. Laserscanning-Mikroskope, entweder von großen Mikroskopherstellern oder selbst gebaut, können für die SRS-Bildgebung verwendet werden. Das verwendete Mikroskop ist ein aufrechtes Laser-Scanning-Mikroskop, das auf einem handelsüblichen aufrechten Mikroskoprahmen aufgebaut ist. Ein Paar 5-mm-Galvospiegel wird verwendet, um den Laserstrahl zu scannen. Für Benutzer, die sich für ein selbstgebautes Laserscanning-Mikroskop entscheiden, verweisen wir auf ein zuvor veröffentlichtes Protokoll für die Konstruktion eines Laserscanning-Mikroskops¹⁶.

Protocol

Alle experimentellen Tierverfahren wurden mit 200 μm, festsitzenden, geschnittenen Mäusegehirnen gemäß dem Protokoll (# 4395-01) durchgeführt, das vom Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Washington genehmigt wurde. Wildtyp-Mäuse (C57BL/6J-Stamm) werden mit CO2 eingeschläfert. Dann wird eine Kraniotomie durchgeführt, um ihr Gehirn zur Fixierung in 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu extrahieren. Die Gehirne sind in eine Mischung aus 3% Agarose un…

Representative Results

Optimierung der spektralen Auflösung:Die Ausbreitung durch ein Material wird durch das dispersive Medium (Länge und Material) und die Wellenlänge beeinflusst. Eine Änderung der Dispersionsstablänge wirkt sich auf die spektrale Auflösung und die Signalgröße aus. Es handelt sich um eine Geben-Nehmen-Beziehung, die je nach Anwendung unterschiedlich abgewogen werden kann. Die Stäbe strecken den Strahlpuls von breit in der Frequenz und schmal in der Zeit zu eng in der Frequenz und breit in der Ze…

Discussion

Das in diesem Protokoll vorgestellte zweifarbige SRS-Bildgebungsschema hängt von der ordnungsgemäßen Implementierung der einfarbigen SRS-Bildgebung ab. Bei der einfarbigen SRS-Bildgebung sind die kritischen Schritte die räumliche Ausrichtung, die zeitliche Ausrichtung, die Modulationstiefe und die Phasenverschiebung. Die räumliche Kombination der beiden Balken wird durch einen dichroitischen Spiegel erreicht. Mehrere Lenkspiegel werden zur Feineinstellung verwendet, wenn die Strahlen zum dichroitischen Spiegel gesch…

Materials

100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.