वास्तविक समय, दो रंग ऊतक निदान के लिए माउस मस्तिष्क के रमन प्रकीर्णन इमेजिंग प्रेरित
Summary
उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली, गैर-विनाशकारी और लेबल-मुक्त इमेजिंग तकनीक है। एक उभरते हुए आवेदन को रमन हिस्टोलॉजी को उत्तेजित किया जाता है, जहां प्रोटीन और लिपिड रमन संक्रमण पर दो-रंग एसआरएस इमेजिंग का उपयोग छद्म-हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन छवियों को उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। यहां, हम ऊतक निदान के लिए वास्तविक समय, दो-रंग एसआरएस इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं।
Abstract
प्रेरित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी ऊतक निदान के लिए एक शक्तिशाली ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के रूप में उभरा है। हाल के वर्षों में, दो-रंग के एसआरएस को हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) -समकक्ष छवियों को प्रदान करने में सक्षम दिखाया गया है जो मस्तिष्क कैंसर के तेजी से और विश्वसनीय निदान की अनुमति देते हैं। इस तरह की क्षमता ने रोमांचक इंट्राऑपरेटिव कैंसर निदान अनुप्रयोगों को सक्षम किया है। ऊतक के दो रंग एसआरएस इमेजिंग या तो एक picosecond या femtosecond लेजर स्रोत के साथ किया जा सकता है। Femtosecond लेजर लचीला इमेजिंग मोड को सक्षम करने का लाभ है, तेजी से hyperspectral इमेजिंग और वास्तविक समय, दो रंग एसआरएस इमेजिंग सहित. चहकते लेजर दालों के साथ एक वर्णक्रमीय-फोकसिंग दृष्टिकोण आमतौर पर उच्च वर्णक्रमीय संकल्प प्राप्त करने के लिए femtosecond लेजर के साथ उपयोग किया जाता है।
दो रंग एसआरएस अधिग्रहण को ऑर्थोगोनल मॉडुलन और लॉक-इन डिटेक्शन के साथ महसूस किया जा सकता है। नाड़ी चहचहाहट, मॉडुलन, और लक्षण वर्णन की जटिलता इस विधि के व्यापक गोद लेने के लिए एक बाधा है। यह लेख एपि-मोड में माउस मस्तिष्क के ऊतकों के वर्णक्रमीय-फोकसिंग एसआरएस और वास्तविक समय, दो-रंग इमेजिंग के कार्यान्वयन और अनुकूलन को प्रदर्शित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग एसआरएस इमेजिंग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है जो एसआरएस की उच्च गति और स्पेक्ट्रोस्कोपिक इमेजिंग क्षमता का लाभ उठाते हैं।
Introduction
पारंपरिक ऊतक निदान एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत परीक्षा के बाद धुंधला प्रोटोकॉल पर भरोसा करते हैं। पैथोलॉजिस्ट द्वारा उपयोग की जाने वाली एक आम धुंधला विधि एच एंड ई स्टेनिंग है: हेमेटोक्सिलिन कोशिका नाभिक को एक बैंगनी नीले रंग का दाग देता है, और ईओसिन बाहरी मैट्रिक्स और साइटोप्लाज्म गुलाबी को दागता है। यह सरल धुंधला कई ऊतक निदान कार्यों, विशेष रूप से कैंसर निदान के लिए पैथोलॉजी में सोने का मानक बना हुआ है। हालांकि, एच एंड ई हिस्टोपैथोलॉजी, विशेष रूप से एक इंट्राऑपरेटिव सेटिंग में उपयोग की जाने वाली जमे हुए सेक्शनिंग तकनीक की अभी भी सीमाएं हैं। धुंधला प्रक्रिया एक श्रमसाध्य प्रक्रिया है जिसमें ऊतक एम्बेडिंग, सेक्शनिंग, फिक्सेशन और स्टेनिंग1 शामिल है। विशिष्ट टर्नअराउंड समय 20 मिनट या उससे अधिक है। जमे हुए सेक्शनिंग के दौरान एच एंड ई का प्रदर्शन करना कभी-कभी अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब मार्जिन मूल्यांकन के लिए 3 डी में सेलुलर सुविधाओं या विकास पैटर्न का मूल्यांकन करने की आवश्यकता के कारण कई वर्गों को एक बार में संसाधित किया जाता है। इसके अलावा, इंट्राऑपरेटिव हिस्टोलॉजिकल तकनीकों को कुशल तकनीशियनों और चिकित्सकों की आवश्यकता होती है। कई अस्पतालों में बोर्ड-प्रमाणित रोगविज्ञानियों की संख्या में सीमा कई मामलों में इंट्राऑपरेटिव परामर्श के लिए एक बाधा है। इस तरह की सीमाओं को डिजिटल पैथोलॉजी और कृत्रिम बुद्धिमत्ता-आधारित निदान 2 में तेजी से विकास हितों के साथ कम किया जा सकताहै। हालांकि, एच एंड ई स्टेनिंग परिणाम परिवर्तनशील होते हैं, जो तकनीशियन के अनुभव के आधार पर होते हैं, जो कंप्यूटर-आधारित निदान 2 के लिए अतिरिक्त चुनौतियां प्रस्तुत करताहै।
इन चुनौतियों को संभावित रूप से लेबल-मुक्त ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीकों के साथ संबोधित किया जा सकता है। ऐसी ही एक तकनीक एसआरएस माइक्रोस्कोपी है। एसआरएस सिंक्रनाइज़ स्पंदित लेजर-पंप और स्टोक्स का उपयोग करता है- उच्च दक्षता3 के साथ आणविक कंपन को उत्तेजित करने के लिए। हाल की रिपोर्टों से पता चला है कि प्रोटीन और लिपिड की एसआरएस इमेजिंग एच एंड ई-समकक्ष छवियों (जिसे उत्तेजित रमन हिस्टोलॉजी या एसआरएच के रूप में भी जाना जाता है) को बरकरार ताजा ऊतक के साथ उत्पन्न कर सकती है, जो किसी भी ऊतक प्रसंस्करण की आवश्यकता को दरकिनार करती है, निदान के लिए आवश्यक समय को काफी कम कर देती है, और इसे इंट्राऑपरेटिव रूप से अनुकूलित किया गया है4। इसके अलावा, एसआरएस इमेजिंग 3 डी छवियां प्रदान कर सकती है, जो निदान के लिए अतिरिक्त जानकारी प्रदान करती है जब 2 डी छवियांअपर्याप्त होती हैं। एसआरएच निष्पक्ष है और डिजिटल छवियों को उत्पन्न करता है जो कंप्यूटर-आधारित निदान के लिए आसानी से उपलब्ध हैं। यह जल्दी से इंट्राऑपरेटिव कैंसर निदान और ट्यूमर मार्जिन विश्लेषण के लिए एक संभावित समाधान के रूप में उभरता है, खासकर मस्तिष्क कैंसर 6,7,8 में। हाल ही में, ऊतक के रासायनिक परिवर्तनों की एसआरएस इमेजिंग को उपयोगी नैदानिक जानकारी प्रदान करने का भी सुझाव दिया गया है जो चिकित्सकों को विभिन्न कैंसर प्रकारों या चरणों 9 को स्थिर करने में मदद कर सकताहै।
ऊतक निदान अनुप्रयोगों में अपनी जबरदस्त क्षमता के बावजूद, एसआरएस इमेजिंग ज्यादातर इमेजिंग प्लेटफॉर्म से जुड़ी जटिलता के कारण प्रकाशिकी में विशिष्ट अकादमिक प्रयोगशालाओं तक सीमित है, जिसमें अल्ट्राफास्ट लेजर, लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप और परिष्कृत डिटेक्शन इलेक्ट्रॉनिक्स शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय, दो-रंग एसआरएस इमेजिंग और माउस मस्तिष्क ऊतक से छद्म-एच एंड ई छवियों की पीढ़ी के लिए एक सामान्य फेम्टोसेकंड लेजर स्रोत के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए एक विस्तृत वर्कफ़्लो प्रदान करता है। प्रोटोकॉल निम्नलिखित कार्यविधियों को कवर करेगा:
संरेखण और चहचहाना अनुकूलन
अधिकांश एसआरएस इमेजिंग योजनाएं उत्तेजना स्रोत के रूप में या तो पिकोसेकंड या फेम्टोसेकंड लेजर का उपयोग करती हैं। femtosecond लेजर के साथ, लेजर की बैंडविड्थ रमन linewidth की तुलना में बहुत बड़ा है। इस सीमा को दूर करने के लिए, संकीर्ण वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन10 को प्राप्त करने के लिए एक पिकोसेकंड टाइमस्केल पर फेम्टोसेकंड लेजर को चहचहाने के लिए एक वर्णक्रमीय फोकसिंग दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है। इष्टतम वर्णक्रमीय संकल्प केवल तभी प्राप्त किया जाता है जब अस्थायी चहचहाहट (जिसे समूह देरी फैलाव या सिर्फ फैलाव के रूप में भी जाना जाता है) पंप और स्टोक्स लेजर के लिए ठीक से मेल खाता है। संरेखण प्रक्रिया और अत्यधिक फैलाव वाले कांच की छड़ का उपयोग करके लेजर बीम के फैलाव को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक चरणों का प्रदर्शन यहां किया गया है।
आवृत्ति अंशांकन
एसआरएस पर ध्यान केंद्रित करने वाले वर्णक्रमीय का एक लाभ यह है कि रमन उत्तेजना को पंप और स्टोक्स लेजर के बीच समय की देरी को बदलकर जल्दी से ट्यून किया जा सकता है। इस तरह की ट्यूनिंग ट्यूनिंग लेजर तरंग दैर्ध्य की तुलना में तेजी से इमेजिंग और विश्वसनीय वर्णक्रमीय अधिग्रहण प्रदान करती है। हालांकि, उत्तेजना आवृत्ति और समय देरी के बीच रैखिक संबंध बाहरी अंशांकन की आवश्यकता होती है। ज्ञात रमन चोटियों के साथ कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग वर्णक्रमीय फोकसिंग एसआरएस के लिए रमन आवृत्ति को कैलिब्रेट करने के लिए किया जाता है।
वास्तविक समय, दो रंग इमेजिंग
बड़े ऊतक नमूनों के विश्लेषण के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए ऊतक निदान अनुप्रयोगों में इमेजिंग गति को बढ़ाना महत्वपूर्ण है। लिपिड और प्रोटीन के एक साथ दो-रंग एसआरएस इमेजिंग लेजर या समय की देरी को ट्यून करने की आवश्यकता को कम करता है, जो इमेजिंग गति को दो गुना से अधिक बढ़ाता है। यह एक उपन्यास ओर्थोगोनल मॉडुलन तकनीक और एक लॉक-इन एम्पलीफायर11 के साथ दोहरे चैनल डिमॉड्यूलेशन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। यह पेपर ऑर्थोगोनल मॉडुलन और दोहरे चैनल छवि अधिग्रहण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
Epi-मोड SRS इमेजिंग
आज तक दिखाए गए एसआरएस इमेजिंग का अधिकांश हिस्सा ट्रांसमिशन मोड में किया जाता है। एपि-मोड इमेजिंग ऊतक12 से बैकस्कैटर फोटॉनों का पता लगाता है। पैथोलॉजी अनुप्रयोगों के लिए, सर्जिकल नमूने काफी बड़े हो सकते हैं। ट्रांसमिशन मोड इमेजिंग के लिए, ऊतक सेक्शनिंग अक्सर आवश्यक होती है, जिसके लिए अवांछित रूप से अतिरिक्त समय की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, एपि-मोड इमेजिंग बरकरार सर्जिकल नमूनों के साथ काम कर सकती है। क्योंकि एक ही उद्देश्य का उपयोग बैकस्कैटर्ड प्रकाश को इकट्ठा करने के लिए किया जाता है, इसलिए ट्रांसमिशन इमेजिंग के लिए आवश्यक उच्च संख्यात्मक-एपर्चर कंडेनसर को संरेखित करने की भी कोई आवश्यकता नहीं है। एपि-मोड भी एकमात्र विकल्प है जब ऊतक सेक्शनिंग मुश्किल होती है, जैसे कि हड्डी के साथ। पहले हमने प्रदर्शित किया है कि मस्तिष्क के ऊतकों के लिए, एपि-मोड इमेजिंग ऊतक की मोटाई के लिए बेहतर इमेजिंग गुणवत्ता प्रदान करता है > 2 मिमी13। यह प्रोटोकॉल ऊतक द्वारा विध्रुवित बिखरे हुए फोटॉनों को इकट्ठा करने के लिए एक ध्रुवीकरण बीम विभाजक (पीबीएस) का उपयोग करता है। अनुकूलित डिटेक्टर असेंबली12 की जटिलता की कीमत पर एक कुंडलाकार डिटेक्टर के साथ अधिक फोटॉन एकत्र करना संभव है। पीबीएस दृष्टिकोण को लागू करने के लिए आसान है (प्रतिदीप्ति के समान), मानक फोटोडायोड के साथ पहले से ही संचरण मोड का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा रहा है।
छद्म एच एंड ई छवि पीढ़ी
एक बार दो रंग की एसआरएस छवियों को एकत्र करने के बाद, उन्हें एच एंड ई धुंधला अनुकरण करने के लिए फिर से रंग दिया जा सकता है। यह पेपर लिपिड और प्रोटीन एसआरएस छवियों को पैथोलॉजी अनुप्रयोगों के लिए छद्म-एच एंड ई एसआरएस छवियों में परिवर्तित करने की प्रक्रिया को दर्शाता है। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले एसआरएस छवियों को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण चरणों का विवरण देता है। यहां दिखाई गई प्रक्रिया न केवल ऊतक निदान पर लागू होती है, बल्कि कई अन्य हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस इमेजिंग अनुप्रयोगों जैसे ड्रग इमेजिंग और चयापचय इमेजिंग14,15 के लिए भी अनुकूलित की जा सकती है।
सामान्य सिस्टम आवश्यकताएँ
इस प्रोटोकॉल के लिए लेजर प्रणाली को 2 सिंक्रनाइज़ femtosecond लेजर बीम आउटपुट करने में सक्षम होना चाहिए। सिस्टम आदर्श रूप से लेजर बीम में से एक के व्यापक तरंग दैर्ध्य ट्यूनिंग के लिए एक ऑप्टिकल पैरामीट्रिक ऑसिलेटर (ओपीओ) की सुविधा देते हैं। इस प्रोटोकॉल में सेटअप एक वाणिज्यिक लेजर सिस्टम इनसाइट DS + का उपयोग करता है जो 80 मेगाहर्ट्ज की पुनरावृत्ति दर के साथ दो लेजर (1,040 एनएम पर एक निश्चित बीम और 680 से 1,300 एनएम तक एक OPO-आधारित ट्यूनेबल बीम) आउटपुट करता है। लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप, या तो प्रमुख माइक्रोस्कोप निर्माताओं या घर-निर्मित से, SRS इमेजिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है। उपयोग किया गया माइक्रोस्कोप एक सीधा लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप है जो एक वाणिज्यिक ईमानदार माइक्रोस्कोप फ्रेम के शीर्ष पर बनाया गया है। लेजर बीम को स्कैन करने के लिए 5 मिमी गैल्वो दर्पणों की एक जोड़ी का उपयोग किया जाता है। एक होमबिल्ट लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप को अपनाने के लिए चुनने वाले उपयोगकर्ताओं के लिए, लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप16 के निर्माण के लिए पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल का संदर्भ लें।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत दो-रंग एसआरएस इमेजिंग योजना एक-रंग एसआरएस इमेजिंग के उचित कार्यान्वयन पर निर्भर करती है। एक-रंग एसआरएस इमेजिंग में, महत्वपूर्ण कदम स्थानिक संरेखण, अस्थायी संरेखण, मॉडुलन गह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को एनआईएच R35 GM133435 द्वारा D.F. द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 100 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-100-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm |
| 20 MHz bandpass filter | Minicircuits | BBP-21.4+ | Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω |
| 200 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-200-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm |
| Achromatic Half Waveplate | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | Broadband half waveplate |
| Achromatic Quarter Waveplate | Union Optic | WPA4210-650-1100-M25.4 | Broadband quarter waveplate |
| Beam Sampler | THORLABS | BSN11 | 10:90 Plate Beamsplitter |
| Dichroic Mirror | THORLABS | DMSP1000 | Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used. |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used. |
| Electrooptic Amplitude Modulator | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used. |
| False H&E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in |
| Fast Photodiode | THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Rise Time |
| Frequency Divider | PRL-220A | Pulse Research Lab | TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output. |
| Highly Dispersive Glass Rods | Union Optic | CYLROD01 | High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm |
| Insight DS+ | Newport | Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. | |
| Lock-in Amplifier | Liquid Instruments | Moku Lab | Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well. |
| Mirrors | THORLABS | BB05-E03-10 | Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used. |
| Motorized Delay Stage | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work. |
| Oil Immersion Condensor | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used. |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS7054 | Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work. |
| Phase Shifter | SigaTek | SF50A2 | For shifting the phase of the modulation frequency |
| Photodiode | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used. |
| Polarizing Beam Splitter | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Broadband polarizing beamsplitter |
| Refactive Index Database | refractiveindex.info | ||
| Retro-reflector | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used. |
| RF Power Amplifier | Minicircuits | ZHL-1-2W+ | Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω |
| Scan Mirrors | Cambridge Technologies | 6215H | We used a 5mm mirror set with silver coating |
| ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Laser scanning microscope control software |
| Shortpass Filter | THORLABS | FESH1000 | 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary. |
| Upright Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope. |
| Water Immersion Objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used. |
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