In tempo reale, a due colori stimolato Raman Scattering Imaging del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti

Summary

La microscopia A dispersione Raman stimolata (SRS) è una tecnica di imaging potente, non distruttiva e priva di etichette. Un’applicazione emergente è l’istologia Raman stimolata, in cui l’imaging SRS a due colori nelle transizioni Raman proteiche e lipidiche viene utilizzato per generare immagini di pseudo-ematossilina ed eosina. Qui, dimostriamo un protocollo per l’imaging SRS a due colori in tempo reale per la diagnosi dei tessuti.

Abstract

La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) è emersa come una potente tecnica di imaging ottico per la diagnosi dei tessuti. Negli ultimi anni, la SRS a due colori ha dimostrato di essere in grado di fornire immagini equivalenti a ematossilina ed eosina (H & E) che consentono una diagnosi rapida e affidabile del cancro al cervello. Tale capacità ha permesso interessanti applicazioni di diagnosi intraoperatoria del cancro. L’imaging SRS a due colori del tessuto può essere eseguito con una sorgente laser a picosecondi o femtosecondi. I laser a femtosecondi hanno il vantaggio di abilitare modalità di imaging flessibili, tra cui l’imaging iperspettrale veloce e l’imaging SRS a due colori in tempo reale. Un approccio di messa a fuoco spettrale con impulsi laser cinguettati viene in genere utilizzato con laser a femtosecondi per ottenere un’elevata risoluzione spettrale.

L’acquisizione SRS a due colori può essere realizzata con modulazione ortogonale e rilevamento lock-in. La complessità del cinguettio, della modulazione e della caratterizzazione degli impulsi è un collo di bottiglia per l’adozione diffusa di questo metodo. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per dimostrare l’implementazione e l’ottimizzazione della messa a fuoco spettrale SRS e l’imaging a due colori in tempo reale del tessuto cerebrale del topo in modalità epi. Questo protocollo può essere utilizzato per un’ampia gamma di applicazioni di imaging SRS che sfruttano l’alta velocità e la capacità di imaging spettroscopico di SRS.

Introduction

La diagnostica tissutale tradizionale si basa su protocolli di colorazione seguiti da un esame al microscopio ottico. Un metodo di colorazione comune utilizzato dai patologi è la colorazione H & E: l’ematossilina colora i nuclei cellulari di un blu violaceo e l’eosina colora la matrice extracellulare e il citoplasma rosa. Questa semplice colorazione rimane il gold standard in patologia per molti compiti di diagnosi tissutale, in particolare la diagnosi del cancro. Tuttavia, l’istopatologia H& E, in particolare la tecnica di sezionamento congelato utilizzata in un ambiente intraoperatorio, ha ancora dei limiti. La procedura di colorazione è un processo laborioso che coinvolge l’incorporamento del tessuto, il sezionamento, la fissazione e la colorazione¹. Il tempo di consegna tipico è di 20 minuti o più. L’esecuzione di H & E durante il sezionamento congelato a volte può diventare più impegnativa quando più sezioni vengono elaborate contemporaneamente a causa della necessità di valutare le caratteristiche cellulari o i modelli di crescita in 3D per la valutazione del margine. Inoltre, le tecniche istologiche intraoperatorie richiedono tecnici e clinici specializzati. La limitazione del numero di patologi certificati in molti ospedali è un vincolo per la consultazione intraoperatoria in molti casi. Tali limitazioni possono essere alleviate con gli interessi di rapido sviluppo nella patologia digitale e nella diagnosi basata sull’intelligenza artificiale². Tuttavia, i risultati della colorazione H & E sono variabili, a seconda dell’esperienza del tecnico, il che presenta ulteriori sfide per la diagnosi basata su computer².

Queste sfide possono potenzialmente essere affrontate con tecniche di imaging ottico senza etichetta. Una di queste tecniche è la microscopia SRS. SRS utilizza laser pulsati sincronizzati ( pompa e Stokes – per eccitare le vibrazioni molecolari con alta efficienza³. Recenti rapporti hanno dimostrato che l’imaging SRS di proteine e lipidi può generare immagini equivalenti A&E (note anche come istologia Raman stimolata o SRH) con tessuto fresco intatto, che bypassa la necessità di qualsiasi elaborazione tissutale, riduce significativamente il tempo necessario per la diagnosi ed è stato adattato intraoperatoriamente⁴. Inoltre, l’imaging SRS può fornire immagini 3D, che offrono informazioni aggiuntive per la diagnosi quando le immagini 2D sono insufficienti⁵. SRH è imparziale e genera immagini digitali che sono prontamente disponibili per la diagnosi basata su computer. Emerge rapidamente come una possibile soluzione per la diagnosi intraoperatoria del cancro e l’analisi del margine tumorale, specialmente nel cancro al cervello ^6,7,8. Più recentemente, l’imaging SRS dei cambiamenti chimici del tessuto è stato anche suggerito per fornire utili informazioni diagnostiche che possono ulteriormente aiutare i medici a stratificare diversi tipi di cancro o stadi⁹.

Nonostante il suo enorme potenziale nelle applicazioni di diagnosi tissutale, l’imaging SRS è per lo più limitato ai laboratori accademici specializzati in ottica a causa della complessità associata alla piattaforma di imaging, che include laser ultraveloci, il microscopio a scansione laser e sofisticata elettronica di rilevamento. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro dettagliato per dimostrare l’uso di una comune sorgente laser a femtosecondi per l’imaging SRS a due colori in tempo reale e la generazione di immagini pseudo-H & E dal tessuto cerebrale del topo. Il protocollo riguarderà le seguenti procedure:

Allineamento e ottimizzazione del cinguettio
La maggior parte degli schemi di imaging SRS utilizza laser a picosecondi o femtosecondi come fonte di eccitazione. Con i laser a femtosecondi, la larghezza di banda del laser è molto più grande della larghezza di linea Raman. Per superare questa limitazione, viene utilizzato un approccio di messa a fuoco spettrale per cinguettare i laser a femtosecondi su una scala temporale di picosecondi per ottenere una risoluzione spettrale ristretta¹⁰. La risoluzione spettrale ottimale si ottiene solo quando il cinguettio temporale (noto anche come dispersione del ritardo di gruppo o semplicemente dispersione) è correttamente abbinato per la pompa e i laser Stokes. La procedura di allineamento e i passaggi necessari per ottimizzare la dispersione dei raggi laser utilizzando barre di vetro altamente dispersive sono dimostrati qui.

Calibrazione della frequenza
Un vantaggio della messa a fuoco spettrale SRS è che l’eccitazione Raman può essere rapidamente regolata modificando il ritardo temporale tra la pompa e i laser Stokes. Tale sintonizzazione offre immagini veloci e un’acquisizione spettrale affidabile rispetto alla sintonizzazione delle lunghezze d’onda laser. Tuttavia, la relazione lineare tra frequenza di eccitazione e ritardo temporale richiede una calibrazione esterna. I solventi organici con picchi Raman noti vengono utilizzati per calibrare la frequenza Raman per la messa a fuoco spettrale SRS.

Imaging a due colori in tempo reale
È importante aumentare la velocità di imaging nelle applicazioni di diagnosi tissutale per ridurre il tempo necessario per l’analisi di campioni di tessuto di grandi dimensioni. L’imaging SRS simultaneo a due colori di lipidi e proteine evita la necessità di sintonizzare il laser o il ritardo temporale, il che aumenta la velocità di imaging di oltre due volte. Ciò si ottiene utilizzando una nuova tecnica di modulazione ortogonale e demodulazione a doppio canale con un amplificatore lock-in¹¹. Questo articolo descrive il protocollo per la modulazione ortogonale e l’acquisizione di immagini a doppio canale.

Imaging SRS in modalità Epi
La maggior parte delle immagini SRS mostrate fino ad oggi viene eseguita in modalità di trasmissione. L’imaging in modalità epi rileva i fotoni retrodiffusi dal tessuto¹². Per le applicazioni di patologia, i campioni chirurgici possono essere piuttosto grandi. Per l’imaging in modalità di trasmissione, è spesso necessario il sezionamento dei tessuti, che richiede indesiderabilmente tempo extra. Al contrario, l’imaging in modalità epi può funzionare con campioni chirurgici intatti. Poiché lo stesso obiettivo viene utilizzato per raccogliere la luce retrodiffusa, non è inoltre necessario allineare un condensatore ad alta apertura numerica necessario per l’imaging della trasmissione. La modalità Epi è anche l’unica opzione quando il sezionamento dei tessuti è difficile, come con l’osso. In precedenza abbiamo dimostrato che per il tessuto cerebrale, l’imaging in modalità epi offre una qualità di imaging superiore per lo spessore del tessuto > 2 mm¹³. Questo protocollo utilizza uno splitter a fascio polarizzatore (PBS) per raccogliere fotoni sparsi depolarizzati dal tessuto. È possibile raccogliere più fotoni con un rivelatore anulare a scapito della complessità del gruppo rivelatore personalizzato¹². L’approccio PBS è più semplice da implementare (simile alla fluorescenza), con il fotodiodo standard già utilizzato per il rilevamento della modalità di trasmissione.

Generazione di immagini Pseudo-H&E
Una volta raccolte le immagini SRS a due colori, possono essere ricolorate per simulare la colorazione H & E. Questo documento dimostra la procedura per convertire le immagini SRS lipidiche e proteiche in immagini SRS pseudo-H & E per applicazioni patologiche. Il protocollo sperimentale descrive in dettaglio i passaggi critici necessari per generare immagini SRS di alta qualità. La procedura mostrata qui non è solo applicabile alla diagnosi tissutale, ma può anche essere adattata per molte altre applicazioni di imaging SRS iperspettrale come l’imaging farmacologico e l’imaging metabolico^14,15.

Requisiti generali di sistema
Il sistema laser per questo protocollo deve essere in grado di emettere 2 raggi laser sincronizzati a femtosecondi. I sistemi sono idealmente dotati di un oscillatore parametrico ottico (OPO) per la sintonizzazione ad ampia lunghezza d’onda di uno dei raggi laser. La configurazione di questo protocollo utilizza un sistema laser commerciale Insight DS + che emette due laser (un raggio fisso a 1.040 nm e un raggio sintonizzabile basato su OPO, che va da 680 a 1.300 nm) con una frequenza di ripetizione di 80 MHz. I microscopi a scansione laser, sia dei principali produttori di microscopi che costruiti in casa, possono essere utilizzati per l’imaging SRS. Il microscopio utilizzato è un microscopio a scansione laser verticale costruito sopra un telaio per microscopio verticale commerciale. Una coppia di specchi galvo da 5 mm viene utilizzata per scansionare il raggio laser. Per gli utenti che scelgono di adottare un microscopio a scansione laser costruito in casa, fare riferimento a un protocollo precedentemente pubblicato per la costruzione di un microscopio a scansione laser¹⁶.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state condotte con cervelli di topo a sezione fissa da 200 μm, in conformità con il protocollo (# 4395-01) approvato dall’Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università di Washington. I topi wild-type (ceppo C57BL/6J) vengono eutanasizzati con CO2. Quindi, viene eseguita una craniotomia per estrarre i loro cervelli per la fissazione in paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato. I cervelli sono incorporati in una mis…

Representative Results

Ottimizzazione della risoluzione spettrale:La dispersione attraverso un materiale è influenzata dal mezzo dispersivo (lunghezza e materiale) e dalla lunghezza d’onda. La modifica della lunghezza dell’asta di dispersione influisce sulla risoluzione spettrale e sulla dimensione del segnale. È una relazione di dare e avere che può essere pesata in modo diverso a seconda dell’applicazione. Le aste allungano l’impulso del fascio dall’essere largo in frequenza e stretto nel tempo ad essere stretto in fr…

Discussion

Lo schema di imaging SRS a due colori presentato in questo protocollo dipende dalla corretta implementazione dell’imaging SRS monocolore. Nell’imaging SRS a un colore, i passaggi critici sono l’allineamento spaziale, l’allineamento temporale, la profondità di modulazione e lo sfasamento. La combinazione spaziale dei due fasci è realizzata da uno specchio dicroico. Diversi specchi dello sterzo vengono utilizzati per la regolazione fine quando si inviano i raggi allo specchio dicroico. Una volta che i fasci sono combinat…

Materials

100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.