조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 두 가지 색상 자극 라만 산란 영상
Summary
자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 강력하고 비파괴적이며 라벨이 없는 이미징 기술입니다. 한 가지 새로운 응용 분야는 자극 라만 조직학이며, 여기서 단백질과 지질 라만 전이에서 두 가지 컬러 SRS 이미징이 의사 헤마톡실린 및 에오신 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 여기에서는 조직 진단을 위한 실시간 이색 SRS 이미징을 위한 프로토콜을 시연합니다.
Abstract
자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 조직 진단을 위한 강력한 광학 이미징 기술로 부상하고 있습니다. 최근 몇 년 동안 두 가지 색상 SRS는 헤마톡실린과 에오신(H&E)과 동등한 이미지를 제공하여 뇌암을 빠르고 안정적으로 진단할 수 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 기능은 흥미 진진한 수술 중 암 진단 응용 프로그램을 가능하게했습니다. 조직의 두 가지 컬러 SRS 이미징은 피코초 또는 펨토초 레이저 소스로 수행 할 수 있습니다. 펨토초 레이저는 빠른 하이퍼스펙트럼 이미징과 실시간 이색 SRS 이미징을 포함한 유연한 이미징 모드를 가능하게 하는 장점이 있습니다. 처프 레이저 펄스를 사용한 스펙트럼 포커싱 접근법은 일반적으로 높은 스펙트럼 분해능을 달성하기 위해 펨토초 레이저와 함께 사용됩니다.
두 가지 색상 SRS 수집은 직교 변조 및 잠금 감지를 통해 실현할 수 있습니다. 펄스 처핑, 변조 및 특성화의 복잡성은이 방법의 광범위한 채택을위한 병목 현상입니다. 이 기사는 에피 모드에서 마우스 뇌 조직의 스펙트럼 포커싱 SRS 및 실시간 이색 이미징의 구현 및 최적화를 입증하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 SRS의 고속 및 분광학적 이미징 기능을 활용하는 광범위한 SRS 이미징 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.
Introduction
전통적인 조직 진단은 염색 프로토콜에 의존하고 광학 현미경으로 검사합니다. 병리학자가 사용하는 일반적인 염색 방법 중 하나는 H & E 염색입니다 : 헤마톡실린은 세포 핵을 자줏빛 파란색으로 염색하고 에오신 염색은 세포외 매트릭스와 세포질 분홍색을 염색합니다. 이 간단한 염색은 많은 조직 진단 작업, 특히 암 진단을위한 병리학의 황금 표준으로 남아 있습니다. 그러나 H&E 조직병리학, 특히 수술내 환경에서 사용되는 냉동 절편술은 여전히 한계가 있다. 염색 절차는 조직 매립, 절개, 고정 및 염색1과 관련된 힘든 과정입니다. 일반적인 처리 시간은 20분 이상입니다. 동결 단면화 중에 H&E를 수행하는 것은 마진 평가를 위해 3D에서 세포 특징이나 성장 패턴을 평가해야 하기 때문에 여러 섹션을 한 번에 처리할 때 더욱 어려워질 수 있습니다. 또한, 수술 내 조직학 기술은 숙련 된 기술자와 임상의가 필요합니다. 많은 병원에서 보드 인증 병리학자 수의 제한은 많은 경우에 수술 내 상담의 제약입니다. 이러한 한계는 디지털 병리학 및 인공 지능 기반 진단에 대한 빠른 개발 관심으로 완화 될 수 있습니다2. 그러나 H&E 염색 결과는 기술자의 경험에 따라 가변적이어서 컴퓨터 기반 진단2에 추가적인 과제가 있습니다.
이러한 과제는 라벨이 없는 광학 이미징 기술로 잠재적으로 해결할 수 있습니다. 이러한 기술 중 하나는 SRS 현미경 검사입니다. SRS는 동기화된 펄스 레이저(펌프 및 스토크스)를 사용하여 고효율로 분자 진동을 자극합니다3. 최근 보고서에 따르면 단백질과 지질의 SRS 이미징은 손상되지 않은 신선한 조직으로 H & E 등가 이미지 (자극 된 라만 조직학 또는 SRH라고도 함)를 생성 할 수 있으며, 이는 조직 처리의 필요성을 우회하고 진단에 필요한 시간을 크게 단축하며 수술 중 적응되었습니다4. 또한, SRS 이미징은 3D 이미지를 제공할 수 있으며, 이는 2D 이미지가 불충분할 때 진단을 위한 추가 정보를 제공한다5. SRH는 편향되지 않으며 컴퓨터 기반 진단에 쉽게 사용할 수 있는 디지털 이미지를 생성합니다. 그것은 수술 중 암 진단 및 종양 마진 분석, 특히 뇌암 6,7,8에서 가능한 해결책으로 빠르게 등장합니다. 보다 최근에, 조직의 화학적 변화에 대한 SRS 영상화는 임상의가 상이한 암 유형 또는단계 9를 계층화하는 것을 추가로 도울 수 있는 유용한 진단 정보를 제공하기 위해 제안되었다.
조직 진단 응용 분야에서 엄청난 잠재력에도 불구하고 SRS 이미징은 초고속 레이저, 레이저 스캐닝 현미경 및 정교한 검출 전자 장치를 포함하는 이미징 플랫폼과 관련된 복잡성으로 인해 광학 전문 학술 실험실로 대부분 제한됩니다. 이 프로토콜은 실시간 두 가지 색상 SRS 이미징을 위한 일반적인 펨토초 레이저 소스의 사용과 마우스 뇌 조직에서 의사 H&E 이미지의 생성을 입증하기 위한 상세한 워크플로우를 제공합니다. 프로토콜은 다음 절차를 다룹니다.
정렬 및 처프 최적화
대부분의 SRS 이미징 체계는 피코초 또는 펨토초 레이저를 여기 소스로 사용합니다. 펨토초 레이저를 사용하면 레이저의 대역폭이 라만 선폭보다 훨씬 큽니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 스펙트럼 포커싱 접근법은 펨토초 레이저를 피코초 타임 스케일로 처핑하여 좁은 스펙트럼 분해능(10)을 달성하기 위해 사용된다. 최적의 스펙트럼 분해능은 시간적 처프(그룹 지연 분산 또는 단지 분산이라고도 함)가 펌프와 스토크스 레이저에 대해 적절하게 정합될 때만 달성됩니다. 고도로 분산된 유리 막대를 사용하여 레이저 빔의 분산을 최적화하는 데 필요한 정렬 절차 및 단계가 여기에서 시연됩니다.
주파수 보정
스펙트럼 포커싱 SRS의 장점은 펌프와 스토크스 레이저 사이의 시간 지연을 변경하여 라만 여기를 신속하게 조정할 수 있다는 것입니다. 이러한 튜닝은 레이저 파장 튜닝에 비해 빠른 이미징과 신뢰할 수 있는 스펙트럼 수집을 제공합니다. 그러나 여기 주파수와 시간 지연 사이의 선형 관계에는 외부 교정이 필요합니다. 알려진 라만 피크를 갖는 유기 용매는 스펙트럼 포커싱 SRS를 위해 라만 주파수를 교정하는데 사용된다.
실시간 두 가지 색상 이미징
조직 진단 응용 프로그램에서 이미징 속도를 높여 대형 조직 표본을 분석하는 데 필요한 시간을 단축하는 것이 중요합니다. 지질과 단백질의 동시 이색 SRS 이미징은 레이저 또는 시간 지연을 조정할 필요성을 없애고, 이는 이미징 속도를 두 배 이상 증가시킨다. 이것은 새로운 직교 변조 기법 및 록인 증폭기(11)를 이용한 이중 채널 복조를 사용함으로써 달성된다. 이 백서에서는 직교 변조 및 이중 채널 이미지 획득을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
에피 모드 SRS 이미징
현재까지 보여진 SRS 이미징의 대부분은 전송 모드에서 수행된다. 에피모드 영상화는 조직(12)으로부터 후방 산란된 광자를 검출한다. 병리학 적 적용의 경우, 수술 표본은 상당히 클 수 있습니다. 전송 모드 이미징의 경우, 조직 절편화가 종종 필요하며, 이는 바람직하지 않게 추가 시간이 필요합니다. 대조적으로, epi-mode 이미징은 손상되지 않은 수술 표본과 함께 작동 할 수 있습니다. 동일한 목적이 후방 산란광을 수집하는 데 사용되기 때문에 전송 이미징에 필요한 높은 수치 조리개 응축기를 정렬할 필요도 없습니다. Epi-mode는 또한 뼈와 같이 조직 절편이 어려울 때 유일한 옵션입니다. 이전에 우리는 뇌 조직의 경우 에피 모드 이미징이 2mm13의 조직 두께에 대해 우수한 이미징 품질을 제공한다는 것> 입증했습니다. 이 프로토콜은 편광 빔 스플리터 (PBS)를 사용하여 조직에 의해 탈분극 된 산란 광자를 수집합니다. 맞춤형 검출기 어셈블리(12)의 복잡성을 희생시키면서 환형 검출기로 더 많은 광자를 수집할 수 있다. PBS 접근 방식은 구현이 더 간단하며 (형광과 유사), 표준 광 다이오드는 이미 전송 모드 감지에 사용되고 있습니다.
의사 H&E 이미지 생성
두 가지 색상의 SRS 이미지가 수집되면 H&E 염색을 시뮬레이션하기 위해 다시 채색할 수 있습니다. 이 논문은 병리학 적용을 위해 지질 및 단백질 SRS 이미지를 의사 H & E SRS 이미지로 변환하는 절차를 보여줍니다. 실험 프로토콜은 고품질 SRS 이미지를 생성하는 데 필요한 중요한 단계를 자세히 설명합니다. 여기에 표시된 절차는 조직 진단에 적용 가능할 뿐만 아니라 약물 이미징 및 대사 영상(14,15)과 같은 많은 다른 하이퍼스펙트럼 SRS 이미징 응용에도 적용될 수 있다.
일반 시스템 요구 사항
이 프로토콜의 레이저 시스템은 2개의 동기화된 펨토초 레이저 빔을 출력할 수 있어야 합니다. 시스템은 이상적으로 레이저 빔 중 하나의 넓은 파장 튜닝을 위한 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 갖추고 있습니다. 이 프로토콜의 설정은 80MHz의 반복률로 두 개의 레이저(1,040nm에서 하나의 고정 빔과 680nm ~ 1,300nm의 OPO 기반 조정 가능 빔 1개)를 출력하는 상용 레이저 시스템 Insight DS+를 사용합니다. 주요 현미경 제조업체 또는 가정용 레이저 스캐닝 현미경을 SRS 이미징에 사용할 수 있습니다. 활용 된 현미경은 상업용 직립 현미경 프레임 위에 구축 된 직립 레이저 스캐닝 현미경입니다. 한 쌍의 5mm 갈보 거울이 레이저 빔을 스캔하는 데 사용됩니다. 가정용 레이저 스캐닝 현미경을 채택하기로 선택한 사용자는 레이저 스캐닝 현미경(16)의 구축을 위해 이전에 공개된 프로토콜을 참조한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에 제시된 두 가지 색상 SRS 이미징 체계는 단색 SRS 이미징의 적절한 구현에 달려 있습니다. 단색 SRS 이미징에서 중요한 단계는 공간 정렬, 시간 정렬, 변조 깊이 및 위상 이동입니다. 두 빔을 공간적으로 결합하는 것은 이색성 거울에 의해 달성된다. 여러 스티어링 미러는 빔을 이색성 거울로 보낼 때 미세 조정에 사용됩니다. 빔이 이색성 미러와 결합되면 결합 된 빔이 IR 카드와 겹치는…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구는 NIH R35 GM133435 내지 D.F.에 의해 지원되었다.
Materials
| 100 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-100-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm |
| 20 MHz bandpass filter | Minicircuits | BBP-21.4+ | Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω |
| 200 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-200-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm |
| Achromatic Half Waveplate | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | Broadband half waveplate |
| Achromatic Quarter Waveplate | Union Optic | WPA4210-650-1100-M25.4 | Broadband quarter waveplate |
| Beam Sampler | THORLABS | BSN11 | 10:90 Plate Beamsplitter |
| Dichroic Mirror | THORLABS | DMSP1000 | Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used. |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used. |
| Electrooptic Amplitude Modulator | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used. |
| False H&E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in |
| Fast Photodiode | THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Rise Time |
| Frequency Divider | PRL-220A | Pulse Research Lab | TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output. |
| Highly Dispersive Glass Rods | Union Optic | CYLROD01 | High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm |
| Insight DS+ | Newport | Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. | |
| Lock-in Amplifier | Liquid Instruments | Moku Lab | Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well. |
| Mirrors | THORLABS | BB05-E03-10 | Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used. |
| Motorized Delay Stage | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work. |
| Oil Immersion Condensor | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used. |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS7054 | Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work. |
| Phase Shifter | SigaTek | SF50A2 | For shifting the phase of the modulation frequency |
| Photodiode | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used. |
| Polarizing Beam Splitter | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Broadband polarizing beamsplitter |
| Refactive Index Database | refractiveindex.info | ||
| Retro-reflector | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used. |
| RF Power Amplifier | Minicircuits | ZHL-1-2W+ | Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω |
| Scan Mirrors | Cambridge Technologies | 6215H | We used a 5mm mirror set with silver coating |
| ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Laser scanning microscope control software |
| Shortpass Filter | THORLABS | FESH1000 | 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary. |
| Upright Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope. |
| Water Immersion Objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used. |
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