Sanntids, tofarget stimulert ramanspredningsavbildning av musehjerne for vevsdiagnose

Summary

Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi er en kraftig, ikke-ødeleggende og etikettfri bildeteknikk. En fremvoksende applikasjon stimuleres Raman histologi, hvor tofarget SRS-avbildning ved protein- og lipid Raman-overgangene brukes til å generere pseudo-hematoksylin- og eosinbilder. Her demonstrerer vi en protokoll for sanntids, tofarget SRS-avbildning for vevsdiagnose.

Abstract

Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi har dukket opp som en kraftig optisk bildeteknikk for vevsdiagnose. De siste årene har tofarget SRS vist seg å kunne gi hematoksylin- og eosin (H&E)-ekvivalente bilder som tillater rask og pålitelig diagnose av hjernekreft. Slik evne har muliggjort spennende intraoperative kreftdiagnoseapplikasjoner. Tofarget SRS-avbildning av vev kan gjøres med enten en picosecond eller femtosecond laserkilde. Femtosecond-lasere har fordelen av å muliggjøre fleksible bildemoduser, inkludert rask hyperspektral avbildning og tofarget SRS-bildebehandling i sanntid. En spektralfokuserende tilnærming med chirped laserpulser brukes vanligvis med femtosecond lasere for å oppnå høy spektral oppløsning.

Tofarget SRS-oppkjøp kan realiseres med ortogonal modulasjon og låsedeteksjon. Kompleksiteten av puls chirping, modulasjon og karakterisering er en flaskehals for den utbredte adopsjonen av denne metoden. Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for å demonstrere implementering og optimalisering av spektralfokuserende SRS og sanntids, tofarget avbildning av musehjernevev i epimodus. Denne protokollen kan brukes til et bredt spekter av SRS-bildebehandlingsprogrammer som utnytter SRS’ høyhastighets- og spektroskopiske bildebehandlingsevne.

Introduction

Tradisjonell vevsdiagnostikk er avhengig av fargingsprotokoller etterfulgt av undersøkelse under et optisk mikroskop. En vanlig fargingsmetode som brukes av patologer er H&E-farging: hematoksylin flekker cellekjerner en purplish blå, og eosin flekker den ekstracellulære matrisen og cytoplasma rosa. Denne enkle fargingen forblir gullstandarden i patologi for mange vevsdiagnoseoppgaver, spesielt kreftdiagnose. Imidlertid har H&E histopatologi, spesielt den frosne seksjoneringsteknikken som brukes i en intraoperativ setting, fortsatt begrensninger. Fargingsprosedyren er en arbeidskrevende prosess som involverer vevsinnbygging, seksjonering, fiksering og farging¹. Den typiske behandlingstiden er 20 min eller lenger. Å utføre H&E under frossen seksjonering kan noen ganger bli mer utfordrende når flere seksjoner behandles samtidig på grunn av behovet for å evaluere mobilfunksjoner eller vekstmønstre i 3D for marginvurdering. Videre krever intraoperative histologiske teknikker dyktige teknikere og klinikere. Begrensning i antall styresertifiserte patologer på mange sykehus er en begrensning for intraoperativ konsultasjon i mange tilfeller. Slike begrensninger kan lindres med de raske utviklingsinteressene i digital patologi og kunstig intelligensbasert diagnose². H&E-fargeresultatene er imidlertid variable, avhengig av teknikerens erfaring, noe som gir ytterligere utfordringer for datamaskinbasert diagnose².

Disse utfordringene kan potensielt løses med etikettfrie optiske bildeteknikker. En slik teknikk er SRS mikroskopi. SRS bruker synkroniserte pulserende lasere – pumpe og Stokes – til å begeistre molekylære vibrasjoner med høy effektivitet³. Nyere rapporter har vist at SRS-avbildning av proteiner og lipider kan generere H&E-tilsvarende bilder (også kjent som stimulert Raman histologi eller SRH) med intakt friskt vev, som omgår behovet for vevsbehandling, forkorter betydelig tiden som trengs for diagnose, og har blitt tilpasset intraoperativt⁴. Videre kan SRS-avbildning gi 3D-bilder, som gir tilleggsinformasjon for diagnose når 2D-bilder ikke er^{tilstrekkelige 5}. SRH er objektiv og genererer digitale bilder som er lett tilgjengelige for datamaskinbasert diagnose. Det fremstår raskt som en mulig løsning for intraoperativ kreftdiagnose og tumormarginanalyse, spesielt i hjernekreft ^6,7,8. Mer nylig har SRS-avbildning av kjemiske endringer i vev også blitt foreslått å gi nyttig diagnostisk informasjon som ytterligere kan hjelpe klinikere med å stratifisere forskjellige krefttyper eller stadier⁹.

Til tross for sitt enorme potensial i vevsdiagnoseapplikasjoner, er SRS-avbildning for det meste begrenset til akademiske laboratorier spesialisert på optikk på grunn av kompleksiteten knyttet til bildeplattformen, som inkluderer ultraraske lasere, laserskanningsmikroskopet og sofistikert deteksjonselelektronikk. Denne protokollen gir en detaljert arbeidsflyt for å demonstrere bruken av en vanlig femtosecond laserkilde for sanntids, tofarget SRS-avbildning og generering av pseudo-H&E-bilder fra musens hjernevev. Protokollen dekker følgende prosedyrer:

Justering og chirp-optimalisering
De fleste SRS-bildebehandlingsordninger bruker enten picosecond- eller femtosecond-lasere som eksitasjonskilde. Med femtosecond lasere er båndbredden til laseren mye større enn Raman linewidth. For å overvinne denne begrensningen, brukes en spektral fokusering tilnærming til å kvitre femtosecond lasere til en picosecond tidsskala for å oppnå smal spektral oppløsning¹⁰. Optimal spektral oppløsning oppnås bare når den tidsmessige chirp (også kjent som gruppeforsinkelsesspredning eller bare spredning) er riktig tilpasset pumpen og Stokes-laserne. Justeringsprosedyren og trinnene som trengs for å optimalisere spredningen av laserstrålene ved hjelp av svært dispergerende glassstenger, demonstreres her.

Frekvenskalibrering
En fordel med spektralfokuserende SRS er at Raman-eksitasjonen raskt kan justeres ved å endre tidsforsinkelsen mellom pumpen og Stokes-laserne. Slik tuning gir rask bildebehandling og pålitelig spektral oppkjøp sammenlignet med tuning laser bølgelengder. Den lineære sammenhengen mellom eksitasjonsfrekvens og tidsforsinkelse krever imidlertid ekstern kalibrering. Organiske løsningsmidler med kjente Raman-topper brukes til å kalibrere Raman-frekvensen for spektralfokuserende SRS.

Tofarget bildebehandling i sanntid
Det er viktig å øke bildehastigheten i vevsdiagnoseapplikasjoner for å forkorte tiden som trengs for å analysere store vevsprøver. Samtidig tofarget SRS-avbildning av lipider og proteiner hindrer behovet for å justere laseren eller tidsforsinkelsen, noe som øker bildehastigheten med mer enn to ganger. Dette oppnås ved å bruke en ny ortogonal modulasjonsteknikk og tokanals demodulering med en innlåsingsforsterker¹¹. Dette dokumentet beskriver protokollen for ortogonal modulasjon og tokanals bildeanskaffelse.

SRS-bildebehandling i epimodus
Mesteparten av SRS-avbildningen som vises til dags dato, utføres i overføringsmodus. Epi-modus bildebehandling oppdager backscattered fotoner fra vev¹². For patologiapplikasjoner kan kirurgiske prøver være ganske store. For avbildning av overføringsmodus er vevsseksjon ofte nødvendig, noe som uønsket krever ekstra tid. I motsetning til dette kan epimodusavbildning fungere med intakte kirurgiske prøver. Fordi det samme målet brukes til å samle tilbakescattered lys, er det heller ikke behov for å justere en høy numerisk blenderåpning kondensator som kreves for overføringsavbildning. Epi-modus er også det eneste alternativet når vevsseksjon er vanskelig, for eksempel med bein. Tidligere har vi vist at for hjernevev tilbyr epimodusavbildning overlegen bildekvalitet for vevstykkelse > 2 mm¹³. Denne protokollen bruker en polariserende strålesplitter (PBS) for å samle spredte fotoner depolarisert av vev. Det er mulig å samle flere fotoner med en ringformet detektor på bekostning av kompleksiteten til tilpasset detektormontering¹². PBS-tilnærmingen er enklere å implementere (ligner fluorescens), med standard fotodiode som allerede brukes til deteksjon av overføringsmodus.

Pseudo-H&E-bildegenerering
Når tofargede SRS-bilder er samlet inn, kan de fargelegges på nytt for å simulere H&E-flekker. Dette dokumentet demonstrerer prosedyren for å konvertere lipid- og protein SRS-bilder til pseudo-H&E SRS-bilder for patologiapplikasjoner. Den eksperimentelle protokollen beskriver kritiske trinn som trengs for å generere SRS-bilder av høy kvalitet. Prosedyren som vises her gjelder ikke bare for vevsdiagnose, men kan også tilpasses for mange andre hyperspektrale SRS-avbildningsapplikasjoner som medikamentavbildning og metabolsk avbildning ^14,15.

Generelle systemkrav
Lasersystemet for denne protokollen må kunne sende ut 2 synkroniserte femtosecond laserstråler. Systemer har ideelt sett en optisk parametrisk oscillator (OPO) for bred bølgelengdejustering av en av laserstrålene. Oppsettet i denne protokollen bruker et kommersielt lasersystem Insight DS+ som sender ut to lasere (en fast stråle på 1040 nm og en OPO-basert justerbar stråle, fra 680 til 1300 nm) med en repetisjonshastighet på 80 MHz. Laserskanningsmikroskoper, enten fra store mikroskopprodusenter eller hjemmebygde, kan brukes til SRS-avbildning. Det brukte mikroskopet er et oppreist laserskanningsmikroskop bygget på toppen av en kommersiell oppreist mikroskopramme. Et par 5 mm galvospeil brukes til å skanne laserstrålen. For brukere som velger å ta i bruk et hjemmebygd laserskanningsmikroskop, kan du se en tidligere publisert protokoll for bygging av et laserskanningsmikroskop¹⁶.

Protocol

Alle eksperimentelle dyreprosedyrer ble utført med 200 μm, faste, seksjonerte musehjerner, i samsvar med protokollen (# 4395-01) godkjent av Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Washington. Wild-type mus (C57BL/6J-stamme) avlives med CO2. Deretter utføres en kraniotomi for å trekke ut hjernen for fiksering i 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann. Hjernene er innebygd i en 3% agarose og 0,3% gelatinblanding og seksjonert i 200 μm tykke skiver av en vibratom. <p clas…

Representative Results

Optimalisere spektraloppløsning:Dispersjon gjennom et materiale påvirkes av dispergeringsmediet (lengde og materiale) og bølgelengde. Endring av dispersjonsstanglengden påvirker spektraloppløsningen og signalstørrelsen. Det er et gi-og-ta-forhold som kan veies annerledes avhengig av applikasjonen. Stengene strekker ut strålepulsen fra å være bred i frekvens og smal i tide til å være smal i frekvens og bred i tide. Figur 7 viser effekten av varierende stangleng…

Discussion

Det tofargede SRS-bildebehandlingsskjemaet som presenteres i denne protokollen, avhenger av riktig implementering av enfarget SRS-avbildning. I enfarget SRS-avbildning er de kritiske trinnene romlig justering, tidsjustering, modulasjonsdybde og faseskift. Romlig kombinere de to bjelkene oppnås av et dikroisk speil. Flere styrespeil brukes til finjustering når du sender bjelkene til det dikroiske speilet. Når bjelkene er kombinert med det dikroiske speilet, kan romlig justering bekreftes ved å plukke av den kombinerte…

Materials

100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.