Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

Summary

A microscopia de dispersão raman estimulada (SRS) é uma técnica de imagem poderosa, não destrutiva e livre de rótulos. Uma aplicação emergente é a histologia raman estimulada, onde imagens de SRS de duas cores nas transições de proteína e lipídio de Raman são usadas para gerar imagens pseudo-hematoxilina e eosina. Aqui, demonstramos um protocolo para imagens de SRS em tempo real e duas cores para diagnóstico de tecido.

Abstract

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) surgiu como uma poderosa técnica de imagem óptica para diagnóstico de tecidos. Nos últimos anos, o SRS de duas cores mostrou-se capaz de fornecer imagens equivalentes à hematoxilina e eosina (H&E) que permitem um diagnóstico rápido e confiável do câncer cerebral. Tal capacidade permitiu aplicações emocionantes de diagnóstico de câncer intraoperatório. A imagem de tecido srs de duas cores pode ser feita com uma fonte de laser picosegundo ou femtosegundo. Os lasers Femtosegundos têm a vantagem de permitir modos de imagem flexíveis, incluindo imagens hiperespectrais rápidas e imagens srs em tempo real de duas cores. Uma abordagem espectral com pulsos laser chirped é tipicamente usado com lasers femtosegundos para alcançar alta resolução espectral.

A aquisição de SRS de duas cores pode ser realizada com modulação ortogonal e detecção de lock-in. A complexidade do pulso, modulação e caracterização é um gargalo para a adoção generalizada desse método. Este artigo fornece um protocolo detalhado para demonstrar a implementação e otimização do SRS focado no espectral e imagens em tempo real de duas cores do tecido cerebral do camundongo no modo epi. Este protocolo pode ser usado para uma ampla gama de aplicações de imagem SRS que aproveitam a alta velocidade e capacidade de imagem espectroscópica do SRS.

Introduction

Os diagnósticos tradicionais de tecido dependem de protocolos de coloração seguidos de exame sob um microscópio óptico. Um método comum de coloração usado pelos patologistas é a coloração de H&E: manchas de hematoxilina nos núcleos celulares um azul arroxeado, e eosina mancha a matriz extracelular e citoplasma rosa. Essa simples coloração continua sendo o padrão ouro na patologia para muitas tarefas de diagnóstico de tecido, particularmente o diagnóstico de câncer. No entanto, a histopatologia H&E, particularmente a técnica de secção congelada usada em um ambiente intraoperatório, ainda tem limitações. O procedimento de coloração é um processo trabalhoso que envolve incorporação de tecidos, secção, fixação e coloração¹. O tempo típico de retorno é de 20 minutos ou mais. O desempenho do H&E durante a seção congelada às vezes pode se tornar mais desafiador quando várias seções são processadas ao mesmo tempo devido à necessidade de avaliar características celulares ou padrões de crescimento em 3D para avaliação de margem. Além disso, técnicas histológicas intraoperatórias exigem técnicos e clínicos qualificados. A limitação no número de patologistas certificados pelo conselho em muitos hospitais é uma restrição para consulta intraoperatória em muitos casos. Tais limitações podem ser aliviadas com os interesses de desenvolvimento rápido na patologia digital e no diagnóstico baseado em inteligência artificial². No entanto, os resultados de coloração do H&E são variáveis, dependendo da experiência do técnico, que apresenta desafios adicionais para o diagnóstico baseado em computador².

Esses desafios podem ser potencialmente enfrentados com técnicas de imagem óptica sem rótulos. Uma dessas técnicas é a microscopia SRS. O SRS usa lasers pulsados sincronizados — bomba e Stokes — para excitar vibrações moleculares com alta eficiência³. Relatórios recentes demonstraram que a imagem de proteínas e lipídios da SRS pode gerar imagens equivalentes a H&E (também conhecida como histologia raman estimulada ou SRH) com tecido fresco intacto, o que contorna a necessidade de qualquer processamento de tecido, encurta significativamente o tempo necessário para o diagnóstico, e foi adaptado intraoperatóriamente⁴. Além disso, a imagem SRS pode fornecer imagens 3D, que oferecem informações adicionais para diagnóstico quando as imagens 2D são insuficientes⁵. O SRH é imparcial e gera imagens digitais prontamente disponíveis para diagnóstico baseado em computador. Ele surge rapidamente como uma possível solução para o diagnóstico de câncer intraoperatório e análise da margem do tumor, especialmente no câncer cerebral ^6,7,8. Mais recentemente, a imagem srs de alterações químicas do tecido também foi sugerida para fornecer informações diagnósticas úteis que podem ajudar ainda mais os médicos a estratificar diferentes tipos de câncer ou^{estágios 9}.

Apesar de seu tremendo potencial em aplicações de diagnóstico de tecidos, a imagem SRS é limitada principalmente a laboratórios acadêmicos especializados em óptica devido à complexidade associada à plataforma de imagem, que inclui lasers ultrarrápidos, microscópio de varredura a laser e sofisticados eletrônicos de detecção. Este protocolo fornece um fluxo de trabalho detalhado para demonstrar o uso de uma fonte de laser femtosegundo comum para imagens srs em tempo real e duas cores e a geração de imagens pseudo-H&E a partir do tecido cerebral do mouse. O protocolo abrangerá os seguintes procedimentos:

Alinhamento e otimização de chirp
A maioria dos esquemas de imagem SRS usam picosegundos ou lasers femtosegundos como fonte de excitação. Com lasers femtosegundos, a largura de banda do laser é muito maior que a largura de linha raman. Para superar essa limitação, uma abordagem focalizante espectral é usada para chirp os lasers femtosegundos para uma escala de tempo picosegundo para alcançar a resolução espectral estreita¹⁰. A resolução espectral ideal só é alcançada quando o chirp temporal (também conhecido como dispersão de atraso de grupo ou apenas dispersão) é devidamente combinado para a bomba e os lasers stokes. O procedimento de alinhamento e as etapas necessárias para otimizar a dispersão dos raios laser usando hastes de vidro altamente dispersivas são demonstradas aqui.

Calibração de frequência
Uma vantagem do srs focalizado espectral é que a excitação de Raman pode ser rapidamente ajustada alterando o atraso de tempo entre a bomba e os lasers Stokes. Tal ajuste oferece imagens rápidas e aquisição espectral confiável em comparação com comprimentos de onda a laser de ajuste. No entanto, a relação linear entre a frequência de excitação e o atraso de tempo requer calibração externa. Solventes orgânicos com picos raman conhecidos são usados para calibrar a frequência raman para srs focalizando espectral.

Imagem em tempo real, de duas cores
É importante aumentar a velocidade de imagem nas aplicações de diagnóstico tecidual para encurtar o tempo necessário para analisar grandes amostras de tecido. A imagem simultânea de SRS de duas cores de lipídios e proteínas evita a necessidade de ajustar o laser ou o atraso de tempo, o que aumenta a velocidade de imagem em mais de duas vezes. Isso é conseguido usando uma nova técnica de modulação ortogonal e demodulação de dois canais com um amplificador lock-in¹¹. Este artigo descreve o protocolo de modulação ortogonal e aquisição de imagens de dois canais.

Imagem SRS do modo epi
A maioria das imagens SRS mostradas até o momento é realizada no modo de transmissão. A imagem do modo epi detecta fótons recattered do tecido¹². Para aplicações patológicas, as amostras cirúrgicas podem ser bastante grandes. Para a imagem do modo de transmissão, a secção tecidual é muitas vezes necessária, o que indesejavelmente requer tempo extra. Em contraste, a imagem do modo epi pode funcionar com amostras cirúrgicas intactas. Como o mesmo objetivo é usado para coletar luz retorcido, também não há necessidade de alinhar um condensador de abertura numérica elevada necessário para a imagem de transmissão. O modo epi também é a única opção quando a seção tecidual é difícil, como com osso. Anteriormente, demonstramos que, para o tecido cerebral, a imagem do modo epi oferece qualidade de imagem superior para a espessura do tecido > 2 mm¹³. Este protocolo usa um divisor de feixe polarizador (PBS) para coletar fótons dispersos despolarizados pelo tecido. É possível coletar mais fótons com um detector anular em detrimento da complexidade do conjunto de detector personalizado¹². A abordagem PBS é mais simples de implementar (semelhante à fluorescência), com o fotodiodo padrão já sendo usado para detecção do modo de transmissão.

Geração de imagens Pseudo-H&E
Uma vez coletadas imagens srs de duas cores, elas podem ser recoloridas para simular a coloração de H&E. Este artigo demonstra o procedimento para converter imagens de SRS lipídicos e proteicos em imagens pseudo-H&E SRS para aplicações patológicas. O protocolo experimental detalha as etapas críticas necessárias para gerar imagens srs de alta qualidade. O procedimento aqui mostrado não é apenas aplicável ao diagnóstico tecidual, mas também pode ser adaptado para muitas outras aplicações de imagem hiperespectral srs, como imagem de drogas e imagem metabólica^14,15.

Requisitos gerais do sistema
O sistema laser para este protocolo deve ser capaz de produzir 2 raios laser femtosegundos sincronizados. Os sistemas possuem idealmente um Oscilador Paramétrico Óptico (OPO) para afinação de comprimento de onda amplo de um dos raios laser. A configuração deste protocolo usa um sistema de laser comercial Insight DS+ que produz dois lasers (um feixe fixo a 1.040 nm e um feixe tunable baseado em OPO, variando de 680 a 1.300 nm) com uma taxa de repetição de 80 MHz. Microscópios de varredura a laser, seja de grandes fabricantes de microscópios ou caseiros, podem ser usados para imagens SRS. O microscópio utilizado é um microscópio de varredura a laser vertical construído em cima de um quadro comercial de microscópio vertical. Um par de espelhos galvo de 5 mm são usados para escanear o raio laser. Para os usuários que optarem por adotar um microscópio de varredura a laser construído em casa, consulte um protocolo publicado anteriormente para a construção de um microscópio de varredura a laser¹⁶.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais de animais foram realizados com cérebros de camundongos fixos e seccionados de 200 μm, de acordo com o protocolo (nº 4395-01) aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Washington. Os camundongos do tipo selvagem (cepa C57BL/6J) são eutanizados com CO2. Em seguida, uma craniotomia é realizada para extrair seus cérebros para fixação em 4% de paraformaldeído em soro fisco tamponado. Os cérebros são embutidos em uma mistura de 3% d…

Representative Results

Otimização da resolução espectral:A dispersão através de um material é afetada pelo meio dispersivo (comprimento e material) e comprimento de onda. A alteração do comprimento da haste de dispersão afeta a resolução espectral e o tamanho do sinal. É uma relação de dar e receber que pode ser ponderada de forma diferente dependendo da aplicação. As hastes esticam o pulso do feixe de ser larga em frequência e estreita no tempo para ser estreita em frequência e larga no tempo. <strong c…

Discussion

O esquema de imagem SRS de duas cores apresentado neste protocolo depende da implementação adequada de imagens SRS de uma cor. Em imagens de SRS de uma cor, as etapas críticas são alinhamento espacial, alinhamento temporal, profundidade de modulação e mudança de fase. A combinação espacial dos dois feixes é realizada por um espelhodicróico. Vários espelhos de direção são usados para ajuste fino ao enviar as vigas para o espelho dicroico. Uma vez que os feixes são combinados com o espelho dicroico, o alinh…

Materials

100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.