Двухцветная стимулированная рамановская рассеянная визуализация мозга мыши в режиме реального времени для диагностики тканей
Summary
Микроскопия с стимулированным комбинационным рассеянием (SRS) является мощным, неразрушающим и безвечным методом визуализации. Одним из новых применений является стимулированная гистология комбинации, где двухцветная визуализация SRS на белковых и липидных рамановских переходах используется для генерации изображений псевдогематоксилина и эозина. Здесь мы демонстрируем протокол для двухцветной визуализации SRS в режиме реального времени для диагностики тканей.
Abstract
Микроскопия стимулированного рамановского рассеяния (SRS) стала мощным оптическим методом визуализации для диагностики тканей. В последние годы было показано, что двухцветная SRS способна предоставлять гематоксилин и эозин (H & E) эквивалентные изображения, которые позволяют быстро и надежно диагностировать рак мозга. Такая возможность позволила создать захватывающие приложения для интраоперационной диагностики рака. Двухцветная SRS-визуализация ткани может быть выполнена с помощью пикосекундного или фемтосекундного лазерного источника. Преимущество фемтосекундных лазеров заключается в том, что они обеспечивают гибкие режимы визуализации, включая быструю гиперспектральную визуализацию и двухцветную визуализацию SRS в режиме реального времени. Спектрально-фокусирующий подход с чирпированными лазерными импульсами обычно используется с фемтосекундными лазерами для достижения высокого спектрального разрешения.
Двухцветное получение SRS может быть реализовано с ортогональной модуляцией и обнаружением блокировки. Сложность щебетания импульсов, модуляции и характеризации является узким местом для широкого распространения этого метода. В данной статье представлен подробный протокол для демонстрации реализации и оптимизации спектрально-фокусирующих SRS и двухцветной визуализации ткани мозга мыши в режиме реального времени в эпирежиме. Этот протокол может использоваться для широкого спектра приложений визуализации SRS, которые используют высокоскоростные и спектроскопические возможности визуализации SRS.
Introduction
Традиционная диагностика тканей опирается на протоколы окрашивания с последующим обследованием под оптическим микроскопом. Одним из распространенных методов окрашивания, используемых патологоанатомами, является окрашивание H &E: гематоксилин окрашивает ядра клеток в пурпурно-синий цвет, а эозин окрашивает внеклеточный матрикс и цитоплазму в розовый цвет. Это простое окрашивание остается золотым стандартом в патологии для многих задач диагностики тканей, особенно для диагностики рака. Тем не менее, гистопатология H&E, особенно метод замороженного сечения, используемый в интраоперационных условиях, по-прежнему имеет ограничения. Процедура окрашивания представляет собой трудоемкий процесс, включающий встраивание, срезание, фиксацию и окрашиваниетканей 1. Типичное время выполнения работ составляет 20 минут или дольше. Выполнение H &E во время замороженного секционирования иногда может стать более сложным, когда обрабатывается несколько секций одновременно из-за необходимости оценки клеточных особенностей или моделей роста в 3D для оценки маржи. Кроме того, интраоперационные гистологические методы требуют квалифицированных техников и клиницистов. Ограничение числа сертифицированных патологоанатомов во многих больницах является ограничением для интраоперационной консультации во многих случаях. Такие ограничения могут быть смягчены с помощью быстрых интересов развития цифровой патологии и диагностики на основе искусственного интеллекта2. Тем не менее, результаты окрашивания H &E варьируются в зависимости от опыта техника, что создает дополнительные проблемы для компьютерной диагностики2.
Эти проблемы потенциально могут быть решены с помощью методов оптической визуализации без этикеток. Одним из таких методов является микроскопия SRS. SRS использует синхронизированные импульсные лазеры — накачку и стокс — для возбуждения молекулярных колебаний с высокой эффективностью3. Недавние отчеты показали, что SRS-визуализация белков и липидов может генерировать H&E-эквивалентные изображения (также известные как стимулированная рамановская гистология или SRH) с неповрежденной свежей тканью, что обходит необходимость любой обработки тканей, значительно сокращает время, необходимое для диагностики, и было адаптировано интраоперационно4. Кроме того, SRS-визуализация может предоставлять 3D-изображения, которые предлагают дополнительную информацию для диагностики, когда 2D-изображений недостаточно5. SRH является непредвзятым и генерирует цифровые изображения, которые легко доступны для компьютерной диагностики. Он быстро появляется в качестве возможного решения для интраоперационной диагностики рака и анализа границ опухоли, особенно при раке головного мозга 6,7,8. Совсем недавно была также предложена визуализация SRS химических изменений ткани для предоставления полезной диагностической информации, которая может дополнительно помочь клиницистам стратифицировать различные типы рака или стадии9.
Несмотря на свой огромный потенциал в приложениях для диагностики тканей, визуализация SRS в основном ограничена академическими лабораториями, специализирующимися на оптике, из-за сложности, связанной с платформой визуализации, которая включает в себя сверхбыстрые лазеры, лазерный сканирующий микроскоп и сложную электронику обнаружения. Этот протокол обеспечивает подробный рабочий процесс для демонстрации использования общего фемтосекундного лазерного источника для двухцветной визуализации SRS в режиме реального времени и генерации псевдо-H &E изображений из ткани мозга мыши. Протокол будет охватывать следующие процедуры:
Выравнивание и оптимизация чирпа
Большинство схем визуализации SRS используют пикосекундные или фемтосекундные лазеры в качестве источника возбуждения. У фемтосекундных лазеров полоса пропускания лазера намного больше, чем ширина рамановской линии. Чтобы преодолеть это ограничение, используется спектральный фокусировочный подход для чирикания фемтосекундных лазеров до пикосекундной временной шкалы для достижения узкого спектрального разрешения10. Оптимальное спектральное разрешение достигается только тогда, когда временное щебетание (также известное как дисперсия групповой задержки или просто дисперсия) правильно подобрано для накачки и лазеров Стокса. Здесь демонстрируется процедура выравнивания и этапы, необходимые для оптимизации дисперсии лазерных лучей с использованием высокодисперсионных стеклянных стержней.
Калибровка частоты
Преимущество спектральной фокусировки SRS заключается в том, что рамановское возбуждение может быть быстро настроено путем изменения временной задержки между накачкой и лазерами Стокса. Такая настройка обеспечивает быструю визуализацию и надежное спектральное получение по сравнению с настройкой длин волн лазера. Однако линейная зависимость между частотой возбуждения и временной задержкой требует внешней калибровки. Органические растворители с известными рамановскими пиками используются для калибровки рамановской частоты для спектральной фокусировки SRS.
Двухцветная визуализация в режиме реального времени
Важно увеличить скорость визуализации в приложениях для диагностики тканей, чтобы сократить время, необходимое для анализа крупных образцов тканей. Одновременная двухцветная SRS-визуализация липидов и белков устраняет необходимость настройки лазера или временной задержки, что увеличивает скорость визуализации более чем в два раза. Это достигается за счет использования новой техники ортогональной модуляции и двухканальной демодуляции с помощью запирающего усилителя11. В данной работе описывается протокол ортогональной модуляции и двухканального получения изображения.
Эпи-режимная визуализация SRS
Большинство изображений SRS, показанных на сегодняшний день, выполняется в режиме передачи. Эпимодальная визуализация обнаруживает обратно рассеянные фотоны из ткани12. Для аппликаций патологии хирургические образцы могут быть довольно большими. Для визуализации в режиме передачи часто необходимо срезание тканей, что нежелательно требует дополнительного времени. Напротив, эпирежимная визуализация может работать с неповрежденными хирургическими образцами. Поскольку одна и та же цель используется для сбора обратно рассеянного света, нет необходимости в выравнивании конденсатора с высокой числовой апертурой, необходимого для передачи изображения. Эпи-режим также является единственным вариантом, когда сечение тканей затруднено, например, с костью. Ранее мы продемонстрировали, что для тканей головного мозга эпирежимная визуализация обеспечивает превосходное качество визуализации для толщины ткани > 2 мм13. Этот протокол использует поляризационный делитель пучка (PBS) для сбора рассеянных фотонов, деполяризованных тканью. Можно собрать больше фотонов с помощью кольцевого детектора за счет сложности настраиваемой детекторной сборки12. Подход PBS проще в реализации (аналогично флуоресценции), при этом стандартный фотодиод уже используется для обнаружения режима передачи.
Генерация псевдо-H&E изображений
После того, как двухцветные изображения SRS собраны, они могут быть перекрашены для имитации окрашивания H &E. В данной работе демонстрируется процедура преобразования изображений липидных и белков SRS в псевдо-H&E SRS изображения для патологических применений. Экспериментальный протокол детализирует критические шаги, необходимые для создания высококачественных изображений SRS. Процедура, показанная здесь, не только применима к диагностике тканей, но также может быть адаптирована для многих других приложений гиперспектральной визуализации SRS, таких как визуализация лекарств и метаболическая визуализация14,15.
Общие системные требования
Лазерная система для этого протокола должна быть способна выводить 2 синхронизированных фемтосекундных лазерных луча. Системы идеально оснащены оптическим параметрическим генератором (OPO) для настройки одной из лазерных лучей с широкой длиной волны. Установка в этом протоколе использует коммерческую лазерную систему Insight DS+, которая выводит два лазера (один фиксированный луч на 1 040 нм и один перестраиваемый луч на основе OPO, в диапазоне от 680 до 1 300 нм) с частотой повторения 80 МГц. Лазерные сканирующие микроскопы, как от крупных производителей микроскопов, так и отечественного производства, могут использоваться для визуализации SRS. Используемый микроскоп представляет собой вертикальный лазерный сканирующий микроскоп, построенный поверх коммерческой вертикальной рамки микроскопа. Пара 5 мм зеркал galvo используется для сканирования лазерного луча. Для пользователей, решивших принять самодельный лазерный сканирующий микроскоп, обратитесь к ранее опубликованному протоколу для построения лазерного сканирующего микроскопа16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Двухцветная схема визуализации SRS, представленная в этом протоколе, зависит от правильной реализации одноцветной визуализации SRS. В одноцветной визуализации SRS критическими шагами являются пространственное выравнивание, временное выравнивание, глубина модуляции и сдвиг фазы. Простра…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано NIH R35 GM133435 до D.F.
Materials
| 100 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-100-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm |
| 20 MHz bandpass filter | Minicircuits | BBP-21.4+ | Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω |
| 200 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-200-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm |
| Achromatic Half Waveplate | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | Broadband half waveplate |
| Achromatic Quarter Waveplate | Union Optic | WPA4210-650-1100-M25.4 | Broadband quarter waveplate |
| Beam Sampler | THORLABS | BSN11 | 10:90 Plate Beamsplitter |
| Dichroic Mirror | THORLABS | DMSP1000 | Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used. |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used. |
| Electrooptic Amplitude Modulator | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used. |
| False H&E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in |
| Fast Photodiode | THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Rise Time |
| Frequency Divider | PRL-220A | Pulse Research Lab | TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output. |
| Highly Dispersive Glass Rods | Union Optic | CYLROD01 | High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm |
| Insight DS+ | Newport | Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. | |
| Lock-in Amplifier | Liquid Instruments | Moku Lab | Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well. |
| Mirrors | THORLABS | BB05-E03-10 | Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used. |
| Motorized Delay Stage | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work. |
| Oil Immersion Condensor | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used. |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS7054 | Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work. |
| Phase Shifter | SigaTek | SF50A2 | For shifting the phase of the modulation frequency |
| Photodiode | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used. |
| Polarizing Beam Splitter | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Broadband polarizing beamsplitter |
| Refactive Index Database | refractiveindex.info | ||
| Retro-reflector | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used. |
| RF Power Amplifier | Minicircuits | ZHL-1-2W+ | Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω |
| Scan Mirrors | Cambridge Technologies | 6215H | We used a 5mm mirror set with silver coating |
| ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Laser scanning microscope control software |
| Shortpass Filter | THORLABS | FESH1000 | 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary. |
| Upright Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope. |
| Water Immersion Objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used. |
References
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).
- Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
- Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
- Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).
- Lu, F. -. K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. 암 연구학. 76 (12), 3451-3462 (2016).
- Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
- Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
- Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
- Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Tsai, P. S., et al., Frostig, R. D., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. , 113-171 (2002).
- Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
- He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
- Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
- Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
- Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).
