Doku Teşhisi için Fare Beyninin Gerçek Zamanlı, İki Renkli Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi
Summary
Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskobu güçlü, tahribatsız ve etiketsiz bir görüntüleme tekniğidir. Ortaya çıkan bir uygulama, protein ve lipit Raman geçişlerinde iki renkli SRS görüntülemenin psödo-hematoksilin ve eozin görüntüleri üretmek için kullanıldığı uyarılmış Raman histolojisidir. Burada, doku teşhisi için gerçek zamanlı, iki renkli SRS görüntüleme için bir protokol gösteriyoruz.
Abstract
Stimulated Raman scattering (SRS) mikroskopisi, doku tanısında güçlü bir optik görüntüleme tekniği olarak ortaya çıkmıştır. Son yıllarda, iki renkli SRS’nin, beyin kanserinin hızlı ve güvenilir teşhisini sağlayan hematoksilin ve eozin (H & E) eşdeğeri görüntüler sağlayabildiği gösterilmiştir. Bu yetenek, heyecan verici intraoperatif kanser teşhisi uygulamalarını mümkün kılmıştır. Dokunun iki renkli SRS görüntülemesi pikosaniye veya femtosaniye lazer kaynağı ile yapılabilir. Femtosaniye lazerler, hızlı hiperspektral görüntüleme ve gerçek zamanlı, iki renkli SRS görüntüleme dahil olmak üzere esnek görüntüleme modları sağlama avantajına sahiptir. Cıvıl cıvıl lazer darbeleri ile spektral odaklama yaklaşımı, yüksek spektral çözünürlük elde etmek için tipik olarak femtosaniye lazerlerle kullanılır.
İki renkli SRS alımı, ortogonal modülasyon ve kilitleme algılama ile gerçekleştirilebilir. Darbe cıvıltısının, modülasyonunun ve karakterizasyonunun karmaşıklığı, bu yöntemin yaygın olarak benimsenmesi için bir darboğazdır. Bu makale, spektral odaklı SRS’nin uygulanmasını ve optimizasyonunu ve epi modda fare beyin dokusunun gerçek zamanlı, iki renkli görüntülenmesini göstermek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, SRS’nin yüksek hızlı ve spektroskopik görüntüleme yeteneğinden yararlanan çok çeşitli SRS görüntüleme uygulamaları için kullanılabilir.
Introduction
Geleneksel doku teşhisi, boyama protokollerine ve ardından optik mikroskop altında incelemeye dayanır. Patologlar tarafından kullanılan yaygın boyama yöntemlerinden biri H & E boyamasıdır: hematoksilin hücre çekirdeklerini morumsu maviye boyar ve eozin hücre dışı matrisi ve sitoplazmayı pembe boyar. Bu basit boyama, başta kanser teşhisi olmak üzere birçok doku teşhisi görevi için patolojide altın standart olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, H&E histopatolojisi, özellikle intraoperatif bir ortamda kullanılan dondurulmuş kesit tekniği, hala sınırlamalara sahiptir. Boyama prosedürü, doku gömme, kesitleme, fiksasyon ve boyama1’i içeren zahmetli bir işlemdir. Tipik geri dönüş süresi 20 dakika veya daha uzundur. Dondurulmuş kesitleme sırasında H&E gerçekleştirmek, marj değerlendirmesi için hücresel özellikleri veya büyüme modellerini 3B’de değerlendirme ihtiyacı nedeniyle aynı anda birden fazla bölüm işlendiğinde bazen daha zor hale gelebilir. Ayrıca, intraoperatif histolojik teknikler yetenekli teknisyenler ve klinisyenler gerektirir. Birçok hastanede kurul onaylı patologların sayısındaki sınırlama, birçok durumda intraoperatif konsültasyon için bir kısıtlamadır. Bu tür sınırlamalar, dijital patoloji ve yapay zeka temelli tanı2’deki hızlı gelişme ilgileri ile hafifletilebilir. Bununla birlikte, H&E boyama sonuçları, teknisyenin deneyimine bağlı olarak değişkendir ve bu da bilgisayar tabanlı tanı için ek zorluklar ortaya çıkarır2.
Bu zorluklar, etiketsiz optik görüntüleme teknikleriyle potansiyel olarak ele alınabilir. Böyle bir teknik SRS mikroskopisidir. SRS, moleküler titreşimleri yüksek verimlilikle uyarmak için senkronize darbeli lazerler (pompa ve Stokes) kullanır3. Son raporlar, proteinlerin ve lipitlerin SRS görüntülemesinin, herhangi bir doku işleme ihtiyacını atlayan, tanı için gereken süreyi önemli ölçüde kısaltan ve intraoperatif olarak uyarlanan bozulmamış taze doku ile H & E eşdeğeri görüntüler (uyarılmış Raman histolojisi veya SRH olarak da bilinir) üretebileceğini göstermiştir4. Ayrıca, SRS görüntüleme, 2D görüntüler yetersiz olduğunda teşhis için ek bilgi sunan 3D görüntüler sağlayabilir5. SRH tarafsızdır ve bilgisayar tabanlı tanılama için hazır olan dijital görüntüler üretir. Özellikle beyin kanserinde intraoperatif kanser tanısı ve tümör marj analizi için olası bir çözüm olarak hızla ortaya çıkmaktadır 6,7,8. Daha yakın zamanlarda, dokunun kimyasal değişikliklerinin SRS görüntülemesinin, klinisyenlerin farklı kanser türlerini veya evrelerini9’u sınıflandırmasına yardımcı olabilecek yararlı tanısal bilgiler sağladığı da önerilmiştir.
Doku teşhisi uygulamalarındaki muazzam potansiyeline rağmen, SRS görüntüleme çoğunlukla ultra hızlı lazerler, lazer tarama mikroskobu ve sofistike algılama elektroniklerini içeren görüntüleme platformuyla ilişkili karmaşıklık nedeniyle optik konusunda uzmanlaşmış akademik laboratuvarlarla sınırlıdır. Bu protokol, gerçek zamanlı, iki renkli SRS görüntüleme için ortak bir femtosaniye lazer kaynağının kullanımını ve fare beyin dokusundan sahte H&E görüntülerinin oluşturulmasını göstermek için ayrıntılı bir iş akışı sağlar. Protokol aşağıdaki prosedürleri kapsayacaktır:
Hizalama ve cıvıl cıvıl optimizasyon
Çoğu SRS görüntüleme şeması, uyarma kaynağı olarak pikosaniye veya femtosaniye lazerleri kullanır. Femtosaniye lazerlerde, lazerin bant genişliği Raman çizgi genişliğinden çok daha büyüktür. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, femtosaniye lazerleri cıvıl cıvıl cıvıl Optimum spektral çözünürlük ancak temporal cıvıltı (grup gecikme dispersiyonu veya sadece dispersiyon olarak da bilinir) pompa ve Stokes lazerleri için uygun şekilde eşleştirildiğinde elde edilir. Hizalama prosedürü ve yüksek oranda dağıtıcı cam çubuklar kullanarak lazer ışınlarının dağılımını optimize etmek için gereken adımlar burada gösterilmiştir.
Frekans kalibrasyonu
Spektral odaklama SRS’nin bir avantajı, Raman uyarımının pompa ve Stokes lazerleri arasındaki zaman gecikmesini değiştirerek hızlı bir şekilde ayarlanabilmesidir. Bu tür ayarlamalar, lazer dalga boylarının ayarlanmasına kıyasla hızlı görüntüleme ve güvenilir spektral kazanım sağlar. Bununla birlikte, uyarma frekansı ile zaman gecikmesi arasındaki doğrusal ilişki harici kalibrasyon gerektirir. Bilinen Raman tepelerine sahip organik çözücüler, spektral odaklama SRS için Raman frekansını kalibre etmek için kullanılır.
Gerçek zamanlı, iki renkli görüntüleme
Büyük doku örneklerinin analizi için gereken süreyi kısaltmak için doku tanı uygulamalarında görüntüleme hızının artırılması önemlidir. Lipitlerin ve proteinlerin eşzamanlı iki renkli SRS görüntülemesi, lazeri veya zaman gecikmesini ayarlama ihtiyacını ortadan kaldırır ve bu da görüntüleme hızını iki kattan fazla artırır. Bu, yeni bir ortogonal modülasyon tekniği ve kilitli bir amplifikatör11 ile çift kanallı demodülasyon kullanılarak elde edilir. Bu yazıda ortogonal modülasyon ve çift kanallı görüntü elde etme protokolü açıklanmaktadır.
Epi-mod SRS görüntüleme
Bugüne kadar gösterilen SRS görüntülemenin çoğunluğu iletim modunda gerçekleştirilmektedir. Epi modlu görüntüleme, doku12’den geri saçılan fotonları algılar. Patoloji uygulamaları için cerrahi örnekler oldukça büyük olabilir. İletim modu görüntüleme için, doku kesiti genellikle gereklidir, bu da istenmeyen bir şekilde ekstra zaman gerektirir. Buna karşılık, epi-mod görüntüleme bozulmamış cerrahi örneklerle çalışabilir. Aynı amaç geri saçılan ışığı toplamak için kullanıldığından, iletim görüntülemesi için gereken yüksek sayısal açıklıklı bir kondenserin hizalanmasına da gerek yoktur. Epi-mod, kemikte olduğu gibi doku kesiti zor olduğunda da tek seçenektir. Daha önce beyin dokusu için epi-mod görüntülemenin 2 mm13‘> doku kalınlığı için üstün görüntüleme kalitesi sunduğunu göstermiştik. Bu protokol, doku tarafından depolarize edilen dağınık fotonları toplamak için polarize edici bir ışın ayırıcı (PBS) kullanır. Özelleştirilmiş dedektör düzeneğinin karmaşıklığı pahasına dairesel bir dedektörle daha fazla foton toplamak mümkündür12. PBS yaklaşımının uygulanması daha kolaydır (floresana benzer), standart fotodiyot zaten iletim modu tespiti için kullanılmaktadır.
Pseudo-H&E görüntü oluşturma
İki renkli SRS görüntüleri toplandıktan sonra, H&E boyamasını simüle etmek için yeniden renklendirilebilirler. Bu yazıda, patoloji uygulamaları için lipid ve protein SRS görüntülerinin psödo-H&E SRS görüntülerine dönüştürülmesi prosedürü gösterilmektedir. Deneysel protokol, yüksek kaliteli SRS görüntüleri oluşturmak için gereken kritik adımları ayrıntılarıyla açıklar. Burada gösterilen prosedür sadece doku tanısına uygulanamaz, aynı zamanda ilaç görüntüleme ve metabolik görüntüleme gibi diğer birçok hiperspektral SRS görüntüleme uygulamasına da uyarlanabilir14,15.
Genel sistem gereksinimleri
Bu protokol için lazer sistemi 2 senkronize femtosaniye lazer ışını üretebilmelidir. Sistemler, lazer ışınlarından birinin geniş dalga boyu ayarı için ideal olarak bir Optik Parametrik Osilatör (OPO) içerir. Bu protokoldeki kurulum, 80 MHz tekrarlama hızına sahip iki lazer (1.040 nm’de bir sabit ışın ve 680 ila 1.300 nm arasında değişen bir OPO tabanlı ayarlanabilir ışın) üreten ticari bir lazer sistemi Insight DS + kullanır. Kullanılan mikroskop, ticari bir dik mikroskop çerçevesinin üzerine inşa edilmiş dik bir lazer tarama mikroskobudur. Lazer ışınını taramak için bir çift 5 mm galvo ayna kullanılır. Ev yapımı bir lazer tarama mikroskobu benimsemeyi seçen kullanıcılar için, lazer tarama mikroskobunun yapımı için daha önce yayınlanmış bir protokole bakın16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde sunulan iki renkli SRS görüntüleme şeması, tek renkli SRS görüntülemenin doğru şekilde uygulanmasına bağlıdır. Tek renkli SRS görüntülemede kritik adımlar uzamsal hizalama, zamansal hizalama, modülasyon derinliği ve faz kaymasıdır. İki kirişin mekansal olarak birleştirilmesi, dikroik bir ayna ile gerçekleştirilir. Kirişleri dikroik aynaya gönderirken ince ayar için birkaç direksiyon aynası kullanılır. Kirişler dikroik ayna ile birleştirildikten sonra, bir IR kartı ile ö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH R35 GM133435 to D.F. tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 100 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-100-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm |
| 20 MHz bandpass filter | Minicircuits | BBP-21.4+ | Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 – 23.6 MHz, 50 Ω |
| 200 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-200-B | Broadband, 650 – 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm |
| Achromatic Half Waveplate | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | Broadband half waveplate |
| Achromatic Quarter Waveplate | Union Optic | WPA4210-650-1100-M25.4 | Broadband quarter waveplate |
| Beam Sampler | THORLABS | BSN11 | 10:90 Plate Beamsplitter |
| Dichroic Mirror | THORLABS | DMSP1000 | Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used. |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used. |
| Electrooptic Amplitude Modulator | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used. |
| False H&E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in |
| Fast Photodiode | THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Rise Time |
| Frequency Divider | PRL-220A | Pulse Research Lab | TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output. |
| Highly Dispersive Glass Rods | Union Optic | CYLROD01 | High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm |
| Insight DS+ | Newport | Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. | |
| Lock-in Amplifier | Liquid Instruments | Moku Lab | Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well. |
| Mirrors | THORLABS | BB05-E03-10 | Broadband Dielectric Mirror, 750 – 1,100 nm. Silver mirrors can also be used. |
| Motorized Delay Stage | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work. |
| Oil Immersion Condensor | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used. |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS7054 | Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work. |
| Phase Shifter | SigaTek | SF50A2 | For shifting the phase of the modulation frequency |
| Photodiode | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used. |
| Polarizing Beam Splitter | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Broadband polarizing beamsplitter |
| Refactive Index Database | refractiveindex.info | ||
| Retro-reflector | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used. |
| RF Power Amplifier | Minicircuits | ZHL-1-2W+ | Gain Block, 5 – 500 MHz, 50 Ω |
| Scan Mirrors | Cambridge Technologies | 6215H | We used a 5mm mirror set with silver coating |
| ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Laser scanning microscope control software |
| Shortpass Filter | THORLABS | FESH1000 | 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary. |
| Upright Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope. |
| Water Immersion Objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used. |
References
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).
- Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
- Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
- Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).
- Lu, F. -. K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. 암 연구학. 76 (12), 3451-3462 (2016).
- Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
- Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
- Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
- Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Tsai, P. S., et al., Frostig, R. D., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. , 113-171 (2002).
- Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
- He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
- Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
- Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
- Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).
