الاختبار الجيني قبل الزرع لمرض الصبغيات العدلية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات
Summary
يعرض البروتوكول الإجراءات الشاملة داخل المختبر المطلوبة في الاختبارات الجينية قبل الزرع لاختلال الصيغة الصبغية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات. نقدم هنا الخطوات التفصيلية لتضخيم الجينوم الكامل ، واختيار جزء الحمض النووي ، وبناء المكتبة ، وإعداد القالب ، وتسلسل تدفق العمل مع نتائج تمثيلية.
Abstract
اكتسب تسلسل الجيل التالي أهمية متزايدة في التطبيق السريري في تحديد المتغيرات الوراثية. في الاختبار الجيني قبل الزرع ، تتمتع هذه التقنية بمزاياها الفريدة في قابلية التوسع والإنتاجية والتكلفة. بالنسبة للاختبار الجيني قبل الزرع لتحليل اختلال الصيغة الصبغية ، يوفر نظام تسلسل الجيل التالي (NGS) القائم على أشباه الموصلات المعروض هنا نهجا شاملا لتحديد المتغيرات الجينية الهيكلية بدقة لا تقل عن 8 ميجا بايت. من الحصول على العينات إلى التقرير النهائي ، تتطلب عملية العمل خطوات متعددة مع الالتزام الوثيق بالبروتوكولات. وبما أن الخطوات الحرجة المختلفة يمكن أن تحدد نتيجة التضخيم، وجودة المكتبة، وتغطية القراءات، ومخرجات البيانات، فإن المعلومات الوصفية مع العرض المرئي بخلاف الكلمات يمكن أن تقدم المزيد من التفاصيل للتشغيل والتلاعب، مما قد يكون له تأثير كبير على نتائج جميع الخطوات الحرجة. ستعرض الطرق المعروضة هنا الإجراءات التي ينطوي عليها تضخيم الجينوم الكامل (WGA) لخلايا Trophectoderm الخزعة (TE) ، وبناء المكتبة الجينومية ، وإدارة التسلسل ، وأخيرا ، إنشاء تقارير متغيرات عدد النسخ.
Introduction
Aneuploidy هو خلل في عدد الكروموسومات من خلال وجود واحد أو أكثر من الكروموسومات الإضافية أو عدم وجود واحد أو أكثر من الكروموسومات. يمكن للأجنة التي تحمل نوعا من اختلال الصيغة الصبغية ، مثل فقدان كروموسوم X واحد (متلازمة تيرنر) ، أو نسخ إضافية من الأوسومات الذاتية ، مثل التثلث الصبغي من autosome 21 (متلازمة داون) ، و 13 (متلازمة باتاو) ، و 18 (متلازمة إدواردز) ، أو الكروموسومات الجنسية الإضافية مثل 47 ، XXY (متلازمة كلاينفلتر) و 47 ، XXX (متلازمة X الثلاثية) ، البقاء على قيد الحياة حتى نهاية العيوب الخلقية1. Aneuploidy هو السبب الرئيسي للإجهاض في الأشهر الثلاثة الأولى وفشل الإخصاب في المختبر (IVF)2. وتفيد التقارير أن معدل اختلال الصيغة الصبغية يمكن أن يتراوح من 25.4٪ -84.5٪ من خلال الطبقات العمرية المختلفة للدورة الطبيعية ومجموعة التحكم الطبية في ممارسة التلقيح الاصطناعي3.
أصبحت تكنولوجيا تسلسل الجيل التالي تطبق بشكل كبير في تحديد المعلومات الوراثية سريريا. يوفر وصولا عمليا إلى تسلسل الجينوم بكفاءة وإنتاجية عالية. على وجه الخصوص ، أحدث تسلسل الجيل التالي ثورة أيضا في تشخيص الاضطرابات ذات العوامل الوراثية واختبارات الشذوذ في الجينوم4. باستخدام تقنية تسلسل أشباه الموصلات لنقل الإشارات الكيميائية مباشرة في تسلسل التفاعل الحيوي إلى بيانات رقمية ، يوفر نظام التسلسل القائم على أشباه الموصلات كشفا مباشرا في الوقت الفعلي لتسلسل البيانات في 3-7 h 5,6.
في إجراء التلقيح الاصطناعي ، يقوم الاختبار الجيني قبل الزرع (PGT) بالتحقيق في الملف الجيني للجنين قبل نقله إلى الرحم لتحسين نتائج التلقيح الاصطناعي وتقليل خطر الاضطرابات الوراثية عند الأطفال حديثي الولادة 1,7. في PGT جنبا إلى جنب مع تقنيات NGS ، يتم تضخيم المواد الوراثية المستخرجة من أقل من 10 خلايا باستخدام مجموعات تضخيم الجينوم الكاملة أو كاشف تضخيم الجينوم الكامل الذي تم تطويره بشكل مستقل. وهذا يتطلب خطوة واحدة فقط في مرحلة التضخيم ولا يتطلب التضخيم المسبق ، للحصول على منتجات تضخيم الجينوم الكامل. يتم تصميم وتطبيق الاشعال أو اللوحات لمتغير رقم النسخ وتسلسل مواقع الجينات الخاصة في المكتبة التي تم إنشاؤها.
يتضمن سير العمل النموذجي للاختبار الجيني قبل الزرع – اختلال الصيغة الصبغية (PGT-A) في NGS إجراءات تسلسلية ، ويتطلب عبء عمل مكثفا من موظفي المختبر8. قد يؤدي بعض سوء التشغيل الناجم عن التراجع عن الإجراء إلى فقدان غير مرغوب فيه لكل من الوقت والموارد في المختبر. ومن المفيد وضع إجراء تشغيل موحد موجز وواضح لسير عمل PGS-NGS؛ ومع ذلك، لا يمكن لبروتوكولات تنسيق الكلمات تقديم معلومات أكثر تفصيلا حول معالجة العينات ومعالجة الأجهزة وإعدادات الأدوات، والتي يمكن تصورها في بروتوكول فيديو. في هذه المقالة ، يمكن أن يوفر سير العمل الذي تم التحقق منه جنبا إلى جنب مع عرض مرئي لتفاصيل التشغيل بروتوكولات إحالة أكثر مباشرة وبديهية في ممارسة PGT على منصة تسلسل أشباه الموصلات.
يصف البروتوكول هنا طريقة تدعم تجميع ما يصل إلى 16 خزعة جنين بالتوازي. بالنسبة للدفعات الأكبر ، يوصى باستخدام بروتوكول تجاري قائم على المجموعة لتسلسل أشباه الموصلات ، مثل Reproes-PGS.
Protocol
Representative Results
Discussion
اختلال الصيغة الصبغية للكروموسومات للأجنة هو سبب نسبة كبيرة من فقدان الحمل ، سواء تم تصوره بشكل طبيعي أو في المختبر الإخصاب (IVF). في الممارسة السريرية للتلقيح الاصطناعي ، يقترح أن فحص اختلال الصيغة الصبغية للجنين ونقل جنين euploidy يمكن أن يحسن نتائج التلقيح الاصطناعي. التهجين الفلوري ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور تشانغيونغ مينغ والسيد رونغجي هو على مشورتهما بشأن تطبيق LIMS الموسع. يتم دعم هذه الدراسة من قبل مشاريع البحوث الخاصة PLA لتنظيم الأسرة (17JS008 ، 20JSZ08) ، وصندوق مختبر قوانغشي الرئيسي لأبحاث أمراض التمثيل الغذائي (رقم 20-065-76) ، ومشروع أبحاث العلوم والتكنولوجيا الصحية المواطن في قوانغتشو (201803010034).
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
References
- Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
- Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
- Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
- Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
- Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
- Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017)
- PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019)
- . Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014)
- Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019)
- Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015)
- Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017)
- Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
- Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
- Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
- de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
- Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
- Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
- McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
- Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
- Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
- Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
- Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).
