Pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie op een halfgeleidergebaseerd next-generation sequencingplatform
Summary
Het protocol presenteert de algemene procedures in het laboratorium die vereist zijn bij pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie op een op halfgeleiders gebaseerd sequencingplatform van de volgende generatie. Hier presenteren we de gedetailleerde stappen van volledige genoomversterking, DNA-fragmentselectie, bibliotheekconstructie, sjabloonvoorbereiding en sequencing-werkstroom met representatieve resultaten.
Abstract
Next-generation sequencing is steeds belangrijker geworden in de klinische toepassing bij de bepaling van genetische varianten. In de pre-implantatie genetische test heeft deze techniek zijn unieke voordelen in schaalbaarheid, doorvoer en kosten. Voor de pre-implantatie genetische test voor aneuploïdie-analyse biedt het hier gepresenteerde semiconductor-based next-generation sequencing (NGS) systeem een alomvattende aanpak om structurele genetische varianten te bepalen met een minimale resolutie van 8 Mb. Van monsteracquisitie tot het eindrapport, het werkproces vereist meerdere stappen met nauwe naleving van protocollen. Aangezien verschillende kritieke stappen het resultaat van versterking, kwaliteit van de bibliotheek, dekking van gelezen gegevens en uitvoer van gegevens kunnen bepalen, zou beschrijvende informatie met visuele demonstratie anders dan woorden meer details kunnen bieden aan de werking en manipulatie, wat een grote impact kan hebben op de resultaten van alle kritieke stappen. De hierin gepresenteerde methoden zullen de procedures weergeven die betrokken zijn bij de versterking van het hele genoom (WGA) van biopsie Trophectoderm (TE) -cellen, genomische bibliotheekconstructie, sequencerbeheer en ten slotte het genereren van rapporten met kopieernummervarianten.
Introduction
Aneuploïdie is de afwijking in het aantal chromosomen door de aanwezigheid van een of meer extra chromosomen of de afwezigheid van een of meer chromosomen. Embryo’s die een vorm van aneuploïdie dragen, zoals het verlies van één X-chromosoom (syndroom van Turner), extra kopieën van autosomen, zoals trisomieën van autosoom 21 (syndroom van Down), 13 (Patau-syndroom) en 18 (Syndroom van Edwards), of extra geslachtschromosomen zoals 47, XXY (Klinefelter-syndroom) en 47, XXX (Triple X-syndroom), kunnen overleven met geboorteafwijkingen1. Aneuploïdie is de primaire oorzaak van miskramen in het eerste trimester en falen van in vitro fertilisatie (IVF)2. Er wordt gemeld dat het aneuploïdiepercentage kan variëren van 25,4% -84,5% door de verschillende leeftijdslagen van de natuurlijke cyclus en de medicinale controlegroep in IVF-praktijk3.
Next-generation sequencing-technologie wordt steeds meer toegepast bij de klinische bepaling van genetische informatie; het biedt praktische toegang tot genoomsequentie met efficiëntie en hoge doorvoer. Met name de volgende generatie sequencing zorgde ook voor een revolutie in de diagnose van aandoeningen met genetische factoren en tests voor abnormiteit in het genoom4. Met behulp van halfgeleidersequencingtechnologie om chemische signalen direct over te brengen in sequencing bioreactie in digitale gegevens, biedt het op halfgeleiders gebaseerde sequentiesysteem een directe, realtime detectie van sequentiegegevens in 3-7 h 5,6.
In een IVF-procedure onderzoekt pre-implantatie genetisch testen (PGT) het genetische profiel van het embryo voordat het in de baarmoeder wordt overgebracht om de IVF-uitkomst te verbeteren en het risico op genetische aandoeningen bij pasgeborenen te verminderen 1,7. In PGT in combinatie met NGS-technieken wordt genetisch materiaal geëxtraheerd uit minder dan 10 cellen versterkt met amplificatiekits voor het hele genoom of een onafhankelijk ontwikkeld reagens voor amplificatie van het hele genoom. Dit vereist slechts één stap in de amplificatiefase en vereist geen pre-amplificatie om amplificatieproducten voor het hele genoom te verkrijgen. Primers of panelen voor copy number variant en speciale gene loci sequencing worden ontworpen en toegepast in de geconstrueerde bibliotheek.
Een typische workflow van pre-implantatie genetisch testen-aneuploïdie (PGT-A) in NGS omvat seriële procedures en vereist een intense werklast van laboratoriumpersoneel8. Sommige misoperaties veroorzaakten het terugdraaien van de procedure kan leiden tot ongewenst verlies van zowel tijd als middelen van het lab. Een beknopte en duidelijke standard operating procedure (SOP) voor PGS-NGS workflow is nuttig; Tekstindelingsprotocollen kunnen echter geen meer gedetailleerde informatie bevatten over monsterverwerking, apparaatmanipulatie en instellingen van instrumenten, die kunnen worden gevisualiseerd in een videoprotocol. In dit artikel zou een gevalideerde workflow in combinatie met een gevisualiseerde demonstratie van operationele details meer directe en intuïtieve verwijzende protocollen kunnen bieden in de PGT-praktijk op een halfgeleidersequencingplatform.
Het protocol beschrijft hier een methode die het batchen van maximaal 16 embryobiopten parallel ondersteunt. Voor grotere batches wordt aanbevolen om een commercieel kitgebaseerd protocol te gebruiken voor halfgeleidersequencing, zoals Reproes-PGS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chromosomale aneuploïdie van embryo’s is de oorzaak van een groot deel van het zwangerschapsverlies, of het nu op natuurlijke wijze is verwekt of in-vitrofertilisatie (IVF). In de klinische praktijk van IVF wordt voorgesteld dat het screenen van de embryo-aneuploïdie en het terugplaatsen van het euploïdie-embryo de uitkomst van IVF zou kunnen verbeteren. Fluorescentie in situ hybridisatie is de vroegste techniek die wordt toegepast voor geslachtsselectie en PGT-A; deze techniek vereist echter meer te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Zhangyong Ming en de heer Rongji Hou bedanken voor hun advies over de uitgebreide toepassing van LIMS. Deze studie wordt ondersteund door PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) en Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
References
- Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
- Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
- Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
- Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
- Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
- Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017)
- PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019)
- . Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014)
- Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019)
- Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015)
- Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017)
- Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
- Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
- Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
- de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
- Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
- Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
- McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
- Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
- Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
- Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
- Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).
