Предимплантационное генетическое тестирование анеуплоидии на платформе секвенирования следующего поколения на основе полупроводников
Summary
Протокол представляет общие лабораторные процедуры, необходимые для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию на основе полупроводниковой платформы секвенирования следующего поколения. Здесь мы представляем подробные этапы амплификации всего генома, выбора фрагментов ДНК, построения библиотеки, подготовки шаблонов и секвенирования рабочего потока с репрезентативными результатами.
Abstract
Секвенирование следующего поколения приобретает все большее значение в клиническом применении при определении генетических вариантов. В предимплантационном генетическом тесте этот метод имеет свои уникальные преимущества в масштабируемости, пропускной способности и стоимости. Для предимплантационного генетического теста для анализа анеуплоидии представленная здесь полупроводниковая система секвенирования следующего поколения (NGS) обеспечивает комплексный подход к определению структурных генетических вариантов с минимальным разрешением 8 Мб. От получения образца до окончательного отчета рабочий процесс требует нескольких этапов с строгим соблюдением протоколов. Поскольку различные критические шаги могут определять результат усиления, качество библиотеки, охват чтения и вывод данных, описательная информация с визуальной демонстрацией, отличной от слов, может предложить более подробную информацию об операции и манипуляции, что может оказать большое влияние на результаты всех критических шагов. Способы, представленные в настоящем описании, будут отображать процедуры, участвующие в амплификации всего генома (WGA) биопсий клеток трофэктодермы (TE), построении геномной библиотеки, управлении секвенсорами и, наконец, генерации отчетов о вариантах номеров копий.
Introduction
Анеуплоидия — это аномалия в количестве хромосом при наличии одной или нескольких лишних хромосом или отсутствии одной или нескольких хромосом. Эмбрионы, которые несут некоторый тип анеуплоидии, такой как потеря одной Х-хромосомы (синдром Тернера), дополнительные копии аутосом, таких как трисомы аутосомы 21 (синдром Дауна), 13 (синдром Патау) и 18 (синдром Эдвардса), или дополнительные половые хромосомы, такие как 47, XXY (синдром Клайнфельтера) и 47, XXX (синдром Тройного X), могут дожить до срока с врожденными дефектами1. Анеуплоидия является основной причиной выкидышей в первом триместре и неудачи экстракорпорального оплодотворения (ЭКО)2. Сообщается, что частота анеуплоидии может варьироваться от 25,4% до 84,5% через различные возрастные слои естественного цикла и медикаментозную контрольную группу в практике ЭКО3.
Технология секвенирования следующего поколения получает широкое применение при клиническом определении генетической информации; он обеспечивает практический доступ к последовательности генома с эффективностью и высокой пропускной способностью. В частности, секвенирование следующего поколения также произвело революцию в диагностике расстройств с генетическими факторами и тестах на аномалию в геноме4. Используя технологию секвенирования полупроводников для непосредственной передачи химических сигналов при секвенировании биореакций в цифровые данные, система последовательностей на основе полупроводников обеспечивает прямое обнаружение в режиме реального времени для последовательности данных за 3-7 ч 5,6.
В процедуре ЭКО предимплантационное генетическое тестирование (PGT) исследует генетический профиль эмбриона перед переносом в матку для улучшения результатов ЭКО и снижения риска генетических нарушений у новорожденных 1,7. В PGT в сочетании с методами NGS генетический материал, извлеченный из менее чем 10 клеток, амплментируется с помощью наборов для амплификации всего генома или независимо разработанного реагента амплификации всего генома. Это требует только одного шага в фазе амплификации и не требует предварительной амплификации для получения продуктов амплификации всего генома. В построенной библиотеке разработаны и применены праймеры или панели для варианта номера копии и специального секвенирования локусов генов.
Типичный рабочий процесс предимплантационного генетического тестирования-анеуплоидии (PGT-A) в NGS включает в себя последовательные процедуры и требует интенсивной рабочей нагрузки лабораторного персонала8. Некоторая неправильная работа, вызванная откатом процедуры, может привести к нежелательной потере как времени, так и ресурсов лаборатории. Полезна краткая и четкая стандартная операционная процедура (СОП) для рабочего процесса PGS-NGS; однако протоколы текстового формата не могут предоставлять более подробную информацию об обработке образцов, манипулировании устройствами и настройках инструментов, которая может быть визуализирована в видеопротоколе. В этой статье проверенный рабочий процесс в сочетании с визуализированной демонстрацией рабочих деталей может предложить более прямые и интуитивно понятные ссылающиеся протоколы в практике PGT на платформе секвенирования полупроводников.
Протокол здесь описывает метод, который поддерживает пакетирование до 16 биопсий эмбрионов параллельно. Для больших партий рекомендуется использовать коммерческий протокол секвенирования полупроводников на основе комплектов, такой как Reproes-PGS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хромосомная анеуплоидия эмбрионов является причиной большой доли потери беременности, будь то естественное оплодотворение или экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО). В клинической практике ЭКО предполагается, что скрининг анеуплоидии эмбриона и перенос эмбриона эуплоидии мож…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Чжанъюн Мина и г-на Жунцзи Хоу за их советы по расширенному применению LIMS. Это исследование поддерживается Специальными исследовательскими проектами НОАК по планированию семьи (17JS008, 20JSZ08), Фондом Гуансийской ключевой лаборатории исследований метаболических заболеваний (No 20-065-76) и Научно-техническим исследовательским проектом гражданского здравоохранения Гуанчжоу (201803010034).
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
References
- Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
- Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
- Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
- Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
- Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
- Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017)
- PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019)
- . Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014)
- Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019)
- Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015)
- Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017)
- Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
- Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
- Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
- de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
- Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
- Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
- McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
- Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
- Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
- Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
- Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).
