Yarı İletken Tabanlı Yeni Nesil Dizileme Platformunda Anöploidi için İmplantasyon Öncesi Genetik Test
Summary
Protokol, yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme platformunda anöploidi için implantasyon öncesi genetik testlerde gerekli olan genel laboratuvar içi prosedürleri sunar. Burada tüm genom amplifikasyonunun, DNA fragmanı seçiminin, kütüphane yapımının, şablon hazırlamanın ve dizileme çalışma akışının ayrıntılı adımlarını temsili sonuçlarla sunuyoruz.
Abstract
Yeni nesil dizileme, genetik varyantların belirlenmesinde klinik uygulamada giderek daha fazla önem kazanmıştır. İmplantasyon öncesi genetik testte, bu tekniğin ölçeklenebilirlik, verim ve maliyet açısından benzersiz avantajları vardır. Anöploidi analizi için implantasyon öncesi genetik test için, burada sunulan yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme (NGS) sistemi, yapısal genetik varyantları minimum 8 Mb çözünürlükte belirlemek için kapsamlı bir yaklaşım sunmaktadır. Örnek alımından nihai rapora kadar, çalışma süreci protokollere sıkı sıkıya bağlı kalarak birden fazla adım gerektirir. Çeşitli kritik adımlar amplifikasyonun sonucunu, kütüphanenin kalitesini, okumaların kapsamını ve verilerin çıktısını belirleyebildiğinden, kelimeler dışında görsel gösterim içeren açıklayıcı bilgiler, tüm kritik adımların sonuçları üzerinde büyük bir etkisi olabilecek işlem ve manipülasyon için daha fazla ayrıntı sunabilir. Burada sunulan yöntemler, biyopsi yapılan Trofektoderm (TE) hücrelerinin tüm genom amplifikasyonunda (WGA), genomik kütüphane yapımında, sıralayıcı yönetiminde ve son olarak kopya numarası varyantlarının raporlarının oluşturulmasında yer alan prosedürleri gösterecektir.
Introduction
Anöploidi, bir veya daha fazla ekstra kromozomun varlığı veya bir veya daha fazla kromozomun yokluğu ile kromozom sayısındaki anormalliktir. Bir X kromozomunun kaybı (Turner sendromu), otozom 21 (Down sendromu), 13 (Patau sendromu) ve 18 (Edwards sendromu) trizomileri gibi otozomların ekstra kopyaları veya 47, XXY (Klinefelter sendromu) ve 47, XXX (Triple X sendromu) gibi ekstra cinsiyet kromozomları gibi bir tür anöploidi taşıyan embriyolar, doğum kusurları1 ile terim olarak hayatta kalabilir. Anöploidi, ilk trimester düşüklerinin ve in vitro fertilizasyon (IVF) başarısızlığının birincil nedenidir2. IVF pratiğinde anöploidi oranının doğal siklus ve ilaçlı kontrol grubunun farklı yaş katmanları boyunca %25.4-%84.5 arasında değişebileceği bildirilmektedir3.
Yeni nesil dizileme teknolojisi, genetik bilginin klinik olarak belirlenmesinde çılgınca uygulanmaktadır; verimlilik ve yüksek verim ile genom dizisine pratik erişim sağlar. Özellikle, yeni nesil dizileme, genetik faktörlere sahip bozuklukların teşhisinde ve genomdaki anormallik testlerinde de devrim yarattı4. Biyo-reaksiyon dizilemedeki kimyasal sinyalleri doğrudan dijital verilere aktarmak için yarı iletken dizileme teknolojisini kullanan yarı iletken tabanlı dizileme sistemi, verileri 3-7 saat 5,6’da sıralamak için doğrudan, gerçek zamanlı bir algılama sağlar.
Bir IVF prosedüründe, implantasyon öncesi genetik test (PGT), IVF sonucunu iyileştirmek ve yenidoğanlarda genetik bozukluk riskini azaltmak için uterusa transfer edilmeden önce embriyonun genetik profilini araştırır 1,7. PGT’de NGS teknikleri ile kombine edildiğinde, 10’dan az hücreden ekstrakte edilen genetik materyal, tüm genom amplifikasyon kitleri veya bağımsız olarak geliştirilmiş bir bütün genom amplifikasyon reaktifi ile çoğaltılır. Bu, amplifikasyon aşamasında sadece bir adım gerektirir ve tüm genom amplifikasyon ürünlerini elde etmek için ön amplifikasyon gerektirmez. Kopya numarası varyantı ve özel gen lokus dizilimi için astarlar veya paneller tasarlanmış ve oluşturulan kütüphanede uygulanmıştır.
NGS’de implantasyon öncesi genetik test-anöploidi (PGT-A) tipik bir iş akışı seri prosedürleri içerir ve laboratuvar personelinin yoğun bir iş yükünü gerektirir8. Prosedürün geri alınmasına neden olan bazı yanlış işlemler, laboratuvarın hem zamanının hem de kaynaklarının istenmeyen şekilde kaybedilmesine neden olabilir. PGS-NGS iş akışı için kısa ve net bir standart çalışma prosedürü (SOP) yararlıdır; ancak, sözcük biçimindeki protokoller, bir video protokolünde görselleştirilebilen örnek işleme, cihaz manipülasyonu ve enstrümanların ayarları hakkında daha ayrıntılı bilgi sunamaz. Bu makalede, çalışma detayının görselleştirilmiş bir gösterimi ile birleştirilmiş doğrulanmış bir iş akışı, yarı iletken bir sıralama platformunda PGT uygulamasında daha doğrudan ve sezgisel yönlendirme protokolleri sunabilir.
Buradaki protokol, paralel olarak 16 embriyo biyopsisine kadar parti yapılmasını destekleyen bir yöntemi açıklamaktadır. Daha büyük partiler için, Reproes-PGS gibi yarı iletken dizileme için ticari kit tabanlı bir protokol kullanılması önerilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embriyoların kromozomal anöploidisi, doğal olarak veya in vitro fertilizasyon (IVF) olarak gebe kalmış olsun, gebelik kaybının büyük bir kısmının nedenidir. IVF’nin klinik pratiğinde, embriyo anöploidisinin taranması ve öploidi embriyosunun transferinin IVF’nin sonucunu iyileştirebileceği önerilmektedir. Floresan in situ hibridizasyon, cinsiyet seçimi ve PGT-A için benimsenen en eski tekniktir; Bununla birlikte, bu teknik laboratuvar personelinden daha fazla teknik uzmanlık gerekti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Zhangyong Ming ve Bay Rongji Hou’ya LIMS genişletilmiş uygulaması hakkındaki tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma PLA Aile Planlaması Özel Araştırma Projeleri (17JS008, 20JSZ08), Guangxi Anahtar Metabolik Hastalıklar Araştırma Laboratuvarı Fonu (No.20-065-76) ve Guangzhou Vatandaş Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Araştırma Projesi (201803010034) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
References
- Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
- Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
- Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
- Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
- Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
- Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017)
- PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019)
- . Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014)
- Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019)
- Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015)
- Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017)
- Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
- Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
- Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
- de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
- Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
- Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
- McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
- Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
- Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
- Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
- Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).
