脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離
Summary
ここでは、柱状磁気活性化細胞選別を利用して、脱髄疾患の動物モデルにおける原発性ミクログリアを単離および精製するためのプロトコルを提示する。
Abstract
ミクログリアは、脳内の常在する自然免疫細胞であり、中枢神経系(CNS)の炎症または傷害に対する主要な応答因子である。ミクログリアは安静状態と活性化状態に分けることができ、脳の微小環境に応じて急速に状態を変化させることができる。ミクログリアは、異なる病理学的条件下で活性化され、異なる表現型を示す。さらに、活性化ミクログリアの多くの異なるサブグループおよび異なるサブグループ間の大きな不均一性が存在する。不均一性は、主にミクログリアの分子特異性に依存する。研究は、ミクログリアが活性化され、炎症性脱髄の病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことを明らかにした。多発性硬化症や神経脊髄炎視神経スペクトラム障害などの炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの特徴をよりよく理解するために、我々は病変周囲一次ミクログリア選別プロトコルを提案する。このプロトコルは、柱状磁気活性化細胞選別(MACS)を利用して高度に精製された原発性ミクログリアを取得し、ミクログリアの分子特性を保存して、炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの潜在的な影響を調査する。
Introduction
ミクログリアは卵黄 – 嚢前駆細胞に由来し、非常に早期に胚性脳に到達し、CNS 1,2の発達に関与する。例えば、彼らはシナプス剪定3と軸索成長4の調節に関与しています。それらはニューロンの生存を促進し、ニューロンの局在化を助ける因子を分泌する5。同時に、異常な細胞やアポトーシス細胞の除去に関与し、正常な脳の発達を確保しています6。さらに、脳の免疫コンピテント細胞として、ミクログリアは脳実質を継続的に監視し、死細胞、機能不全シナプス、および細胞破片を除去する7。ミクログリアの活性化は、炎症性脱髄疾患、神経変性疾患、脳腫瘍など、さまざまな疾患において重要な役割を果たしていることが実証されています。多発性硬化症(MS)における活性化ミクログリアは、希突起膠細胞前駆細胞(OPC)の分化およびミエリン破片8を包み込むことによってミエリンの再生に寄与する。
アルツハイマー病(AD)では、アミロイドベータ(Aβ)の蓄積がミクログリアを活性化し、ミクログリアの貪食および炎症機能に影響を及ぼす9。グリオーマ関連ミクログリア(GAM)と呼ばれるグリオーマ組織中の活性化ミクログリアは、グリオーマの進行を調節し、最終的に患者の予後に影響を与える可能性がある10。この活性化はミクログリアトランスクリプトームを深く変化させ、形態学的変化、免疫受容体の発現、貪食活性の増加、およびサイトカイン分泌の増強をもたらす11。疾患関連ミクログリア(DAM)、活性化応答ミクログリア(ARM)、およびミクログリア神経変性表現型(MGnD)などの神経変性疾患における活性化ミクログリアの異なるサブセットが存在する8。
同様に、ミクログリアの複数の動的機能サブセットも、炎症性脱髄疾患12において脳内に共存する。ミクログリアの異なるサブセット間の不均一性を理解することは、炎症性脱髄疾患の病因を調査し、それらの潜在的な治療戦略を見つけるために不可欠である。ミクログリアの不均一性は、主に分子特異性8に依存する。ミクログリアの分子変化を正確に記述することは、不均一性の研究に不可欠である。単一細胞RNAシーケンシング(RNA-seq)技術の進歩により、病理学的状態における活性化ミクログリアの分子特性の同定が可能になった13。したがって、細胞集団を単離する能力は、特定の条件下でこれらの標的細胞をさらに調査するために重要である。
ミクログリアの特徴と機能を理解するために行われる研究は、培養フラスコに付着し、他の混合グリア細胞と共にプラスチック表面上で増殖するマウスの子犬脳(1〜3日齢)から多数の初代ミクログリアを調製および培養できることが見出されているので、通常 、インビトロ 研究である。続いて、純粋なミクログリアは、混合グリア細胞14、15の異なる接着性に基づいて単離され得る。しかし、この方法は周産期脳からミクログリアを単離することしかできず、数週間かかる。細胞培養における潜在的な変数は、分子発現16などのミクログリア特性に影響を与え得る。さらに、これらの方法で単離されたミクログリアは、CNS疾患の状態をシミュレートすることによってのみ インビトロ 実験に参加することができ、 in vivo 疾患状態におけるミクログリアの特徴および機能を表すことができない。したがって、成体マウスの脳からミクログリアを単離する方法を開発する必要がある。
蛍光活性化細胞選別(FACS)と磁気分離は、広く使用されている2つの方法ですが、それぞれ異なる制限があります16,17,18,19。それぞれの長所と短所は、議論のセクションで対比されます。MACS技術の成熟は、細胞を迅速に精製する可能性を提供する。Huangらは、脳内の脱髄病変を標識する便利な方法を開発した20。これら2つの技術的アプローチを組み合わせることで、我々は迅速かつ効率的な柱状CD11b磁気分離プロトコルを提案し、成体マウス脳の脱髄病変の周りのミクログリアを単離し、ミクログリアの分子特性を保存するための段階的な説明を提供する。局所脱髄病変は、プロトコル21を開始する3日前に脳梁に2μLのリゾレシチン溶液(0.9%NaCl中の1%LPC)を定位注射することによって引き起こされた。このプロトコルは、インビトロ実験で次のステップを実行するための基礎を築きます。さらに、このプロトコルは時間を節約し、さまざまな実験で広く使用するために実現可能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、脱髄病変の周囲のミクログリアを単離する方法を提案しており、これは炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの機能的特徴の研究に役立つ可能性がある。CD11bビーズを用いて捕捉されたミクログリアは、高純度および生存率を示す。プロトコルの重要なステップには、病巣の正確な局在化と最適なミクログリア精製が含まれます。プロトコルステップ2.1では、病変を正確?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、同済病院(HUST)優秀若手科学者財団(助成金番号2020YQ06)の支援を受けた。
Materials
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
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