Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria in modelli animali di malattie demielinizzanti, utilizzando lo smistamento cellulare magnetico-attivato colonnare.
Abstract
Le microglia, le cellule immunitarie innate residenti nel cervello, sono i principali rispondenti all’infiammazione o alle lesioni nel sistema nervoso centrale (SNC). La microglia può essere suddivisa in stato di riposo e stato attivato e può cambiare rapidamente stato in risposta al microambiente del cervello. Le microglia saranno attivate in diverse condizioni patologiche e presenteranno fenotipi diversi. Inoltre, ci sono molti sottogruppi diversi di microglia attivate e una grande eterogeneità tra diversi sottogruppi. L’eterogeneità dipende principalmente dalla specificità molecolare della microglia. Gli studi hanno rivelato che la microglia sarà attivata e svolgerà un ruolo importante nel processo patologico di demielinizzazione infiammatoria. Per comprendere meglio le caratteristiche della microglia nelle malattie infiammatorie demielinizzanti come la sclerosi multipla e il disturbo dello spettro della neuromielite ottica, proponiamo un protocollo di smistamento microgliale primario perilesionale. Questo protocollo utilizza il cartomanziamento cellulare attivato magneticamente colonnare (MACS) per ottenere microglia primarie altamente purificate e preservare le caratteristiche molecolari della microglia per studiare i potenziali effetti della microglia nelle malattie demielinizzanti infiammatorie.
Introduction
Le microglia provengono da progenitori del sacco vitellino, che raggiungono il cervello embrionale molto presto e partecipano allo sviluppo del SNC 1,2. Ad esempio, sono coinvolti nella potatura sinaptica3 e nella regolazione della crescita assonale4. Secernono fattori che promuovono la sopravvivenza neuronale e aiutano la localizzazione neuronale5. Allo stesso tempo, sono coinvolti nella rimozione di cellule anormali e cellule apoptotiche per garantire il normale sviluppo del cervello6. Inoltre, come cellule immuno-competenti del cervello, le microglia sorvegliano continuamente il parenchima cerebrale per eliminare le cellule morte, le sinapsi disfunzionali e i detriti cellulari7. È stato dimostrato che l’attivazione microgliale svolge un ruolo importante in una varietà di malattie, tra cui malattie infiammatorie demielinizzanti, malattie neurodegenerative e tumori cerebrali. Le microglia attivate nella sclerosi multipla (SM) contribuiscono alla differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) e alla rigenerazione della mielina inghiottendo i detritimielinici 8.
Nella malattia di Alzheimer (AD), l’accumulo di amiloide-beta (Aβ) attiva la microglia, che colpisce le funzioni fagocitiche e infiammatorie della microglia9. La microglia attivata nel tessuto del glioma, chiamata microglia associata al glioma (GAM), può regolare la progressione del glioma e, infine, influenzare la prognosi dei pazienti10. L’attivazione altera profondamente il trascrittoma microgliale, con conseguenti cambiamenti morfologici, espressione dei recettori immunitari, aumento dell’attività fagocitica e aumento della secrezione di citochine11. Esistono diversi sottoinsiemi di microglia attivate nelle malattie neurodegenerative come la microglia associata alla malattia (DAM), la microglia a risposta attivata (ARM) e il fenotipo neurodegenerativo microgliale (MGnD)8.
Allo stesso modo, più sottoinsiemi funzionali dinamici di microglia coesistono anche nel cervello nelle malattie infiammatorie demielinizzanti12. Comprendere l’eterogeneità tra diversi sottoinsiemi di microglia è essenziale per studiare la patogenesi delle malattie demielinizzanti infiammatorie e per trovare le loro potenziali strategie terapeutiche. L’eterogeneità della microglia dipende principalmente dalla specificità molecolare8. È essenziale descrivere accuratamente le alterazioni molecolari della microglia per lo studio dell’eterogeneità. I progressi nella tecnologia di sequenziamento dell’RNA a singola cellula (RNA-seq) hanno permesso l’identificazione delle caratteristiche molecolari della microglia attivata in condizioni patologiche13. Pertanto, la capacità di isolare le popolazioni cellulari è fondamentale per ulteriori indagini su queste cellule bersaglio in condizioni specifiche.
Gli studi condotti per comprendere le caratteristiche e le funzioni della microglia sono di solito studi in vitro, poiché è stato riscontrato che un gran numero di microglia primarie possono essere preparate e coltivate dal cervello del cucciolo di topo (1-3 giorni), che si attaccano ai palloni di coltura e crescono sulla superficie plastica con altre cellule gliali miste. Successivamente, la microglia pura può essere isolata in base alla diversa adesività delle cellule gliali miste14,15. Tuttavia, questo metodo può solo isolare la microglia dal cervello perinatale e richiede diverse settimane. Le potenziali variabili in coltura cellulare possono influenzare le caratteristiche microgliali come l’espressione molecolare16. Inoltre, le microglia isolate con questi metodi possono partecipare solo a esperimenti in vitro simulando le condizioni delle malattie del SNC e non possono rappresentare le caratteristiche e le funzioni della microglia negli stati di malattia in vivo. Pertanto, è necessario sviluppare metodi per isolare la microglia dal cervello del topo adulto.
Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e la separazione magnetica sono due metodi ampiamente utilizzati, sebbene abbiano i loro diversi limiti 16,17,18,19. I loro rispettivi vantaggi e svantaggi saranno contrastati nella sezione di discussione. La maturazione della tecnologia MACS offre la possibilità di purificare rapidamente le cellule. Huang et al. hanno sviluppato un metodo conveniente per etichettare le lesioni demielinizzanti nel cervello20. Combinando questi due approcci tecnici, proponiamo un protocollo di separazione magnetica CD11b colonnare rapido ed efficiente, fornendo una descrizione passo-passo per isolare la microglia attorno a lesioni demielinizzanti nel cervello di topo adulto e preservare le caratteristiche molecolari della microglia. Le lesioni demielinizzanti focali sono state causate dall’iniezione stereotassica di 2 μL di soluzione di lisolecitina (1% LPC in 0,9% NaCl) nel corpo calloso 3 giorni prima di iniziare il protocollo21. Questo protocollo pone le basi per eseguire il passo successivo in esperimenti in vitro. Inoltre, questo protocollo consente di risparmiare tempo e rimane fattibile per un uso diffuso in vari esperimenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo propone un metodo per isolare la microglia attorno alle lesioni demielinizzanti, che può aiutare a studiare le caratteristiche funzionali della microglia nelle malattie infiammatorie demielinizzanti. Le microglia catturate utilizzando perline CD11b mostrano un’elevata purezza e vitalità. I passaggi critici del protocollo includono la localizzazione precisa dei fuochi e la purificazione microgliale ottimale. Nella fase di protocollo 2.1, è necessario iniettare la soluzione NR 2 ore prima di sacrificare il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto dalla Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).
Materials
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
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