小動物モデルにおけるアデノ随伴ウイルスベクターの結膜下投与
Summary
本稿では、マウスの眼組織に対する有効なベクター送達法として、輸液/離脱シリンジポンプと気密着式シリンジとマイクロインジェクション針を組み合わせた注射システムを用いて結膜下注射を実証しています。この注射システムは、他の眼内投与経路にも適応可能である。
Abstract
眼疾患には、広範囲の遺伝性遺伝性疾患および後天性疾患が含まれ、複数の投与経路を介したアクセスが比較的容易であるため、局所薬物送達の魅力的な標的です。結膜下注射(SCJ)は、簡単で安全であり、通常は外来で行われるため、他の眼内投与経路よりも優れています。小動物へのSCJ注射は、通常、目の大きさのために手術用顕微鏡の支援を必要とする。以前の研究では、特定のアデノ随伴ウイルス(AAV)血清型のSCJ注射が、眼表面、眼の筋肉、角膜、視神経の標的形質導入のための有効な遺伝子送達戦略であり、多くの眼疾患の治療に潜在的なアプローチを提供することが実証されています。
ここでは、プログラム可能な注入/離脱シリンジポンプ(一貫した正確な注入速度と圧力を可能にする)とマイクロインジェクション針と結合された気密取り外し可能なシリンジで構成される注入システムを使用したマウスモデルでのSCJ注射の詳細なプロトコルが提示されます。注射システムは、小動物における間質内、カメラ内、硝子体内、網膜下注射などの他の眼内投与経路にも適応可能である。眼の遺伝子治療研究のためのアデノ随伴ウイルスベクターの送達が記載されているが、本明細書のプロトコルは、小動物モデルにおける様々な眼科溶液にも適合させることができる。投与ルートの主要な実践的なステップ、注射プラットフォームのセットアップ、注射の準備、および直接の経験からのヒントについて詳しく説明します。さらに、所望の組織へのAAV送達確認のための一般的な検証技術についても簡単に説明します。
Introduction
眼疾患は、遺伝性疾患と後天性疾患の両方の広い範囲を網羅しています。2015年には、世界中で推定3,600万人が法的に失明し、10億人以上が少なくともある程度の視覚障害に苦しんでおり、すべてのレベルで緩和の取り組みを拡大する必要性が浮き彫りになりました1。眼薬を送達するための主な方法には、点眼薬または結膜下注射(SCJ)、皮内注射、硝子体内注射、および網膜下注射などの局所投与と局所投与の両方が含まれます。非侵襲的局所療法は眼科用薬物の最も一般的な送達方法であり、多くの前眼部障害に広く使用されていますが、角膜の解剖学的障壁の存在は、局所投与された物質のバイオアベイラビリティ、生体分布、および有効性に課題を提示し、それが多くの内眼疾患の最良の候補治療経路ではない可能性があることを示唆しています。疾患の影響を受ける特定の眼コンパートメントへの局所注射は、より効果的で標的を絞った薬物送達アプローチである可能性があります2。ただし、繰り返しの注射に起因する副作用は、投与戦略を複雑にする可能性があります。.理想的には、治療は単回投与後に長期的な治療効果を維持する必要があります。.したがって、遺伝子治療は、必要な注射の回数を最小限に抑え、眼疾患の治療のための持続的な導入遺伝子発現を提供するための有望な選択肢である3,4。
多数のウイルスおよび非ウイルスベクターが遺伝子治療に利用可能です。ただし、AAVベクターは、その優れた安全性プロファイルのために高い関心を集めています。AAVは、1965年にAtchisonらによってアデノウイルス製剤の汚染物質として最初に発見された小さな一本鎖非エンベロープDNAウイルスです5,6AAVは、その後1980年代に遺伝子送達のための効率的なウイルスベクターとして設計され、眼疾患を含む多くの疾患に最適な遺伝子治療ベクターになりました。 過去数十年にわたって。これらの中で最も注目に値するのは、まれな後眼疾患であるレーバー先天性アマウロシスを治療するために米国食品医薬品局によって承認された最初の市販の遺伝子治療薬であるボレチゲンネパルボベックです。ボレチゲンネパルボベックは臨床開発の障壁をうまく克服しましたが、追加の眼遺伝子治療の商業化には課題が残っています。例えば、ボレチゲンネパルボベックは、網膜下注射を介して生存可能な網膜細胞を保持する患者に投与される。したがって、生存可能な網膜細胞を欠くより進行した形態の疾患を有する患者は、臨床的利益をもたらさないため、治療の資格がない。さらに、眼の炎症、白内障、網膜裂傷、黄斑症、および疼痛を含む、網膜下注射手順に関連する既知の合併症が観察された7,8。この手順に関連する他の懸念には、出血、網膜剥離、眼内炎、および眼組織の破壊による眼免疫特権状態の取り消しの可能性が含まれます9,10,11,12。したがって、SCJ注射などの侵襲性の低い遺伝子送達経路を探索する努力はますます重要になっている13、14、15、16、17。
結膜は、3〜5層の細胞を含み、前眼を内眼瞼に接続する薄い膜です。SCJ注射は、加齢黄斑変性症、緑内障、網膜炎、後部ブドウ膜炎などの眼疾患の治療のために、眼の前部および/または後部の両方への眼科用薬物送達に臨床的に使用されます18,19。それらは比較的簡単に実行でき、外来患者の設定20での眼科用薬物送達に日常的に使用され、やや痛みがなく、眼の免疫特権を損なうことはなく、投与された薬物が視神経を含む大きな眼窩周囲領域に広がることを可能にします。したがって、SCJ注射はAAV遺伝子治療アプリケーションにとって魅力的な投与経路です。マウスにSCJ注射を介して投与された天然のAAV血清型は、安全性、形質導入効率、血清免疫原性、生体分布、および組織特異性について以前に特徴付けられています13、16、21。これらのデータは、SCJ投与による個々の眼組織への遺伝子送達が正式な可能性であることを示した。
この論文では、マウスモデルでAAVベクターを送達するためのSCJ注入のための簡単で適応可能なプロトコルについて説明します。このアプローチの再現性を確保するために、実体顕微鏡、プログラム可能な注入/離脱シリンジポンプ(一貫した正確な注入速度と圧力を可能にする)、およびマイクロインジェクションニードルと組み合わせた気密取り外し可能なシリンジで構成される注入システムについて説明します。このシステムは、小動物の間質内、カメラ内、硝子体内、網膜下注射などの他の眼内投与経路に適応できます。さらに、フルオレセイン色素は、AAV注射部位の可視化を可能にするためにしばしば利用される。投与ルートの主要な実践的なステップ、注射プラットフォームのセットアップ、注射の準備、および直接の経験からのヒントについて詳しく説明します。最後に、所望の組織へのAAV送達を確認するための一般的な検証技術について簡単に説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
AAVを介した遺伝子治療は、眼疾患の治療に大きな可能性を秘めています。現在の眼科遺伝子治療は、硝子体内注射と網膜下注射の2つの主要な局所投与経路に依存しています。残念ながら、どちらの経路も侵襲的であり、網膜剥離、白内障形成、眼内炎などの重篤な合併症を引き起こす可能性があります。したがって、SCJ注射などの比較的侵襲性の低い経路の調査は非常に興味深いものです。…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この研究で使用されたscAAV8-GFPベクターを提供してくれたノースカロライナ大学のベクターコア、CGIBD組織学コア、およびこの研究の臨床評価の側面を支援してくれたブライアンC.ギルガー博士の研究室に感謝します。この研究は、ファイザー-NC Biotech特別ポスドクフェローシップと、American Society of Gene & Cell TherapyおよびCystic Fibrosis Foundationのキャリア開発賞の支援を受けました。内容は著者の責任であり、必ずしもAmerican Society of Gene & Cell TherapyまたはCystic Fibrosis Foundationの公式見解を表すものではありません。
Materials
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
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