Tekniske antivirale midler via overflateplasmonresonans

Summary

Denne protokollen beskriver nye verktøy for SPR-bindingsanalyser for å undersøke CV-N-binding til HA, S-glykoprotein, relaterte hybrid-type glykaner og oligosakkarider med høy mannose. SPR brukes til å bestemme K_D for binding av enten dimerisk eller monomer CV-N til disse glykanene.

Abstract

Overflateplasmonresonans (SPR) brukes til å måle hemagglutinin (HA) binding til domenebyttet Cyanovirin-N (CV-N) dimer og for å overvåke interaksjoner mellom mannosylerte peptider og CV-Ns bindingssted for høy affinitet. Viruskonvoluttpigger gp120, HA og Ebola glykoprotein (GP) 1,2 har blitt rapportert å binde både høy- og lavaffinitetsbindingssteder på dimerisk CVN2. Dimannosylert HA-peptid er også bundet på de to bindingsstedene med lav affinitet til et konstruert molekyl av CVN2, som bærer et høyaffinitetssted for den respektive liganden og mutert for å erstatte en stabiliserende disulfidbinding i karbohydratbindende lomme, og bekrefter dermed multivalent binding. HA-binding er vist til ett bindingssted med høy affinitet av pseudoantistoff CVN2 ved en dissosiasjonskonstant (K_D) på 275 nM som ytterligere nøytraliserer humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) gjennom oligomerisering. Korrelering av antall disulfidbroer i domenebyttet CVN2, som reduseres fra 4 til 2 ved å erstatte cystiner i polare restpar av glutaminsyre og arginin, resulterer i redusert bindingsaffinitet til HA. Blant de sterkeste interaksjonene er Ebola GP1,2 bundet av CVN2 med to bindingssteder med høy affinitet i det nedre nanomolare området ved bruk av konvoluttglykanet uten transmembrandomene. I denne studien måles binding av det multispesifikke monomere CV-N til alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glykoprotein ved K D = 18,6 μM sammenlignet med nanomolar K_D til de andre virustoppene, og via dets reseptorbindende domene i midten av μ-molare området.

Introduction

Tetherin-assosiert antiviral aktivitet induseres av interferon-α, og den består av proteinbaserte tethers, som fører til oppbevaring av fullt dannede virioner på infiserte celleoverflater¹. Nødvendigheten av tetheringlykosylering ved hemming av virusfrigjøring er fortsatt usikker, noe som antyder betydningen av glykosyleringsmønstre på rekombinant uttrykte glykaner for in vitro-studier ^1,2, som avhenger av konformasjonen av (i tilfelle influensavirus) overflateuttrykt influensa hemagglutinin HA ^3,4 . Det har blitt bemerket at modifisering av oligosakkarid bundet til N-bundet glykosylering er nok for tetherinmediert begrensning av HIV type-1-frigjøring², mens dimerisering spiller en viktig rolle i å forhindre virusfrigivelse, og derved involverer transmembrandomenet eller glykosylfosfatidyl-inositol (GPI) -anker for tethering av spirende virioner⁵ . Unike funksjoner er beskrevet for humant og murine tetherin for å blokkere flere innkapslede virus, retrovirus og filovirus. BST-2 / tetherin er et interferoninduserbart antiviralt protein av den medfødte immuniteten^1,6, som virker med bredspektret antiviral aktivitet og motvirkes av konvoluttglykoproteiner⁵ for enten å translokere tetherin eller forstyrre strukturen av tetherin ⁶. For eksempel er overflate-uttrykt konvoluttglykoprotein HA og neuraminidase på influensa A-virus kjent for tetherinantagonisme på en stammespesifikk måte⁷, noe som letter anerkjennelsen av vertsreseptorbindingssteder⁸. Glykanmålrettede antistoffer studeres i støkiometrien av deres interaksjoner med de raskt tilpassede glykanskjoldene på HA, noe som resulterer i bindingsaffinitet til influensa A H3N2 og H1N1 subtyper⁴.

For å belyse bindingsmekanismene mellom antivirale midler og viruskonvoluttpigger, dvs. karbohydratligander, og komplementære immunologiske og spektroskopiske metoder, syntetiseres mono-, di- og tri-mannose-deler kjemisk. De mannosylerte peptidene dannes via azidoglykosylering av glykosyler {beta}-peracetater til 1,2-trans glykosylazider transformasjon⁹, som etterligner de typisk funnet N-acetylglukosamin og høymannose oligosakkarider på overflaten av livstruende virus. Triazolbioisostere brukes til å etterligne koblinger som danner mannosylert rest av HA-peptid¹⁰ og letter stedsspesifikke interaksjoner med antivirale CV-N-derivater rundt det andre N-koblede glykosyleringspunktet på HA-hodedomenet (HA-topp med 4 N-bundne glykaner N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Interaksjoner mellom glutaminsyre (Glu) og arginin (Arg) og den resulterende helix-dipolen manifesterte god stabilitet av både modellpeptider og proteiner, men visualiseres ved hjelp av SPR. Hvis sammenlignet med å gjenkjenne et enkelt kjemisk syntetisert glykosyleringssted på HA¹⁰ ved direkte å hemme reseptorbinding på glykandelene, vises en høyere affinitet av en fire-site mutert Fc-struktur til reseptoren for å fremkalle effektorfunksjoner in vivo, og avslører den ikke-relaterte sammensetningen av N-bundne glykaner festet til Fc-mutanten for å være mekanistisk bestemt¹³.

CV-N viser antiviral aktivitet mot HIV 14,15, influensa¹⁶ og Ebola-virus, som er mediert av nanomolar binding til oligosakkaridmodifikasjoner med høy mannose på konvoluttpiggproteiner^12,17,18,19. Influensa HA-binding til ett karbohydratbindende sted med høy affinitet (H) i CV-N eller to Hs i kovalent koblet dimerisk CVN2 er bestemt til å ha likevektsdissosiasjonskonstanter (K D) = henholdsvis 5,7 nM (figur 1A) og K_D = 2,7 nM. Både CV-N og CVN2 har en eller to karbohydratbindende steder med lav affinitet (L) s 12,17,20,21. Ebola GP1,2 binder seg til 2H CVN2 med affiniteter i det nedre nanomolare området (K_D = 26 nM). CV-N WT binding til Ebola GP1,2 og HA viser slektskap fra K D = 34 nM til K_D = 5,7 nM (A/New York/55/04)¹². Lektiner, som CV-N, som spesifikt retter seg mot høymannoseglykaner på virushylsene, hemmer ytterligere replikasjon av hepatitt C-virus, SARS-CoV, herpesvirus, Marburg-virus og meslingvirus²².

Det lille CV-N-molekylet har blitt studert grundig i mer enn 20 år, da det funksjonaliserer for å binde et bredt spekter av virus for å hemme viral oppføring^16,18. Strukturelle analyser og bindingsaffinitetsanalyser indikerer kryssbinding av to L-er i en domenebyttet CVN2-dimer ved bivalent binding i mikromolarområdet for å øke aviditeten til virale konvoluttglykoproteiner^10,19. Selektiv binding av Manα1-2Manα på Man(8) D1D3-armer og Man(9) består av to bindingssteder med forskjellig affinitet lokalisert på motsatte proteinprotomerer²⁰, og når dermed nanomolære bindingsaffiniteter (figur 1B). CVN2 anses således som et pseudoantistoff angående dets anvendelse for å binde epitoper på HIV gp120, i likhet med virusnøytraliserende antistoffer¹⁷. Her er forfatteren interessert i å undersøke den potensielle bindingen av CVN2 til SARS-CoV-2-piggen via sitt reseptorbindende domene (RBD). Bindingskurver for immobilisert humant angiotensinkonverterende enzym (ACE)-2 med SARS-CoV-2 RBD resulterer i K_D = 4,7 nM for denne biologisk relevante bindingsinteraksjonen²³.

Derimot gjenkjenner utvalgte immunglobulinklasser spesifikke og konsistente strukturelle proteinmønstre, som gir et substrat for affinitetsmodning i de membranforankrede HA-regionene²⁴. CV-N viser svært potent aktivitet i nesten alle influensa A- og B-virus¹⁶, og det er et bredt nøytraliserende antiviralt middel. Vår kunnskap er ufullstendig på plasseringen av målrettede epitoper på stammen av HA1 og HA2 som muligens involverer epitopiske strukturer for glykanmålretting av svært nøytraliserende antistoffer og sammenlignet med lektinbinding²⁵.

Figur 1: Skjematisk fremstilling av SPR-bindingsanalysen for CV-N til viruskonvoluttpigger. (A) SPR-analyse for CV-N-binding til ligand: HA protein i full lengde (90 kDa). Kinetisk datasett (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) som viser dobbeltreferert binding i sanntid til influensa HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variant V2 binding til immobilisert ligand DM innenfor et konsentrasjonsområde på 500 nM til 16 μM. Sekvens: L-rester er uthevet i gult. H-rester er uthevet i grått. E58 og R73 er en erstatning for cysteiner i wildtypeproteinet og gjør V2 til en stabil proteinfold med tre i stedet for fire disulfidbindinger Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Mens glykanskjoldet på den membrandistale HA-toppdelen induserer høy affinitetsbinding til CV-N 12, har CVN2-binding til HA ved siden av en disulfidbro av HA-toppdelen videre blitt observert på lavaffinitetsstedene^10,12. Ulike polare interaksjoner og interaksjonssteder identifiseres i karbohydratbinding ved CV-N. Disse interaksjonene verifiseres ved å generere knock-out-varianter i bindingsstedet for å korrelere bindingsaffiniteter til in silico predikert glykosylering¹². Prosjektet tar derfor sikte på å sammenligne tidligere testede kjemisk mannosylerte HA-peptider i bindingsaffinitet og spesifisitet med korte peptidsekvenser fra SARS-relaterte 2019-nCoV-pigger og SARS-CoV-2, naturlig forekommende modifisert av et lite antall forskjellige N-bundne glykosyleringssteder og O-bundet glykosylering. Ved hjelp av kryo-elektronmikroskopi og bindingsanalyser rapporterer Pinto og kolleger et monoklonalt antistoff, S309, som potensielt gjenkjenner en epitop på SARS-CoV-2-piggprotein som inneholder et konservert glykan i Sarbecovirus-underslekten, uten å konkurrere med reseptorvedlegg²⁶. Protokollen i denne studien beskriver hvordan design, uttrykk og karakterisering av CV-N-varianter er viktig for å studere hvordan CV-N og CVN2 binder seg til glykosylerte proteiner og syntetiske mannosylerte peptider ved hjelp av SPR-teknologien^10,12.

Tandemkoblede dimer CVN2L0²⁷ og bindingsstedsvarianter (V2-V5) uttrykkes rekombinant og varianter er med disulfidbindingserstatninger (C58E og C73R) (figur 2A). Også en mutant med en enkeltpunktsmutasjon E41A er forberedt fordi denne posisjonen har blitt sett på som en intermolekylær krysskontaktrest. Denne mutanten er et annet interessant molekyl for SPR-bindingsmålinger mellom lektin- og høymannoseoligosakkarider som dechiffrerer bindingsdomener og tillater sammenligning med den dimeriske formen. Den domenebyttede krystallstrukturen til CVN2 viser en fleksibel kobling, som strekker seg mellom 49 og 54 rester. De to domenene kan fortsette å bevege seg rundt hengslet som stive legemer, og utvikle enten en monomer gjennom intramolekylære domeneinteraksjoner (domene A -rester 1-39;90-101- med domene B -rester 40-89) eller en dimer ved intermolekylær domenebytte [domene A (av den første monomeren) med domene B (av den andre), og domene B (av den første monomeren) med domene A (av den andre kopien)]. Det er ingen nære interaksjoner mellom de to protomerenes A- og B-domener, bortsett fra Glu41²⁸. Genet for CV-N kan utvikles ved hjelp av en repeterende PCR-metode med 40-mer syntetiserte oligoer²⁹ og blir deretter subklonert inn i NdeI- og BamHI-stedene til pET11a for transformasjon (elektroporering) til elektrokompetente celler som beskrevet av Keeffe, JR.27. Proteinet, som brukes til å oppnå den respektive krystallstrukturen (PDB ID 3S3Y), inkluderer en N-terminal 6-histidinrensingskode etterfulgt av et Faktor Xa proteasespaltningssted. Site-rettet mutagenese brukes til å lage punktmutasjoner, bytte kodoner og sette inn eller slette enkle eller flere baser eller kodoner for aminosyreutveksling. Disse transformasjonene gir uvurderlig innsikt i proteinfunksjon og struktur. Rekombinant uttrykt og renset CV-N, CVN2 og CVN3 har blitt biofysisk godt studert^20,21,27, er billige å produsere^, og brukes derfor til å karakterisere bindingsanalyser til glykaner immobilisert på SPR-sensorbrikker. Konvensjonell enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) gir mindre reproduserbarhet angående immobiliseringsteknikken til glykanligander og forvandler sanntidsbinding av forskjellige bindingsstedsvarianter, som er vist for SPR, til endepunktanalyser.

Bindingsaffinitetsvarianten CVN2L0-V2 (en intakt fold av homodimer CV-N med en disulfidbrosubstitusjon¹⁰) uttrykkes med en His-tag i Escherichia coli (E. coli), renset over Ni-NTA-kolonnen ved bruk av affinitetskromatografi og testet for binding til HA (H3N2), monomannosylert HA-peptid og dimannosylert HA-peptid ved bruk av SPR. Kjemisk mannosylerte peptider, eller HA- og S-protein, er alle ligander og amin koblet til den hydrofile chipoverflaten via reaktive estere eller biotin-streptavidin protein engineering. Den samme prosedyren for sekvensielle løp brukes på disse ligandene, injisering av forskjellige fortynninger av CV-N og varianter av CV-N (og CVN2) for å oppnå kinetisk informasjon for molekylære interaksjonsanalyser som beskrevet nedenfor³⁰. RBD-immobilisert SPR-sensorbrikke brukes til bindingsstudier på CV-N til S-peptider, og affiniteter sammenlignes med SARS-CoV-2-binding med human ACE2.

Protocol

For denne studien har et CVN-lite ubiquitinlignende modifikator (SUMO) fusjonsprotein blitt brukt i enzymbundne immunosorbentanalyser i stedet for CV-N og er egnet for cellebaserte analyser. Rekombinant full lengde influensa A-virus HA H3-protein oppnås kommersielt (se materialtabell) eller uttrykkes i pattedyrs HEK293-cellelinjer og baculovirusinfiserte insektceller i henhold til standardprotokoller12. Wuhan-1 spikeprotein uttrykkes i pattedyr HEK293-celler. Syntesen av monomann…

Representative Results

Et dimerisk domenebyttet CVN2L0-molekyl testes for binding til HA-toppregionen i tre separate SPR-eksperimenter, og bindingsaffinitet presenteres i KD-verdier. Domene B antas å omfatte H-bindende steder, som påvirkes ved å erstatte en disulfidbinding i ioniske rester, og domene A danner L10,18. Enkeltinjeksjoner av CVN2L0 og variantene V2 (tre disulfidbroer) og V5 (to disulfidbroer) testes først for binding til den HA-koblede sensorbrikken for å e…

Discussion

CV-Ns bindingsaffinitet er korrelert med antall funksjonelle bindingssteder [2H på domener B, og 2L på domene(r) A når de konstrueres som domenebyttede dimer]. En variant med endret bindingsaffinitet (CVN2L0-V2, en homodimer stabil fold av CV-N som består av en disulfidbro knock-out) uttrykkes i E. coli, renset og positivt testet for binding til HA-protein (H3N2) ved bruk av SPR¹⁰, og viser en konformasjonsendring ved binding av HA med enten H eller L karbohydratbindende steder og K<s…

Materials

Äkta primeplus	Cytiva
Amicon tubes	Merck	C7715
Ampillicin	Sigma-Aldrich	A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge	Beckman Coulter	B06320
Cell spreader	Sigma-Aldrich	HS86655	silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos	Sigma-Aldrich	OLIGO
Custom Gensynthesis	GenScript	#1390661	cloning vector: pET27b(+)
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL	Thermo Scientific	50-105-5354
Dionex UlitMate 3000	Thermo Scientific	IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)	Fisher Scientific	ER1701
DTT	Merck	DTT-RO
EDC	Merck	39391
EDTA	Merck	E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes	Eppendorf	30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes	Eppendorf	30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge	Sigma-Aldrich	Z606235
Ethanol	Merck	51976
Ethanolamine HCl	Merck	E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack	Corning	352057
Glucose	Merck	G8270
Glycine HCl	Merck	55097
HA H3 protein	Abcam	ab69751
HEPES	Merck	H3375
His-select Ni2+	Merck	H0537
Imidazole	Merck	I2399
IPTG	Merck	I6758
Kanamycin A	Sigma-Aldrich	K1377
Kromasil 300-5-C4	Nouryon
LB agar	Merck	52062
LB agar	Merck	19344
LB Lennox	Merck	L3022
Lysozyme	Merck	10837059001
Magnesium chloride	Merck	M8266
Magnesium sulfate	Merck	M7506
NaH2P04	Merck	S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000CLAPTOP
NaOH	Merck	S5881
NHS	Merck	130672
NZ amine (casein hydrolysate)	Merck	C0626
PBS	Merck	806552
PD MidiTrap G-10	Sigma-Aldrich	GE28-9180-11
Peptone	Merck	70171
pET11a	Merck Millipore (Novagen)	69436
PMSF	Merck	PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)	Qiagen	27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9	Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System	Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis	Reichert
SDS	Merck	11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid	Stratagene	#200518
Sodim chloride	Merck	S9888
Sodium acetate.Trihydrate	Merck	236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M	XanTec bioanalytics	SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D	XanTec bioanalytics	SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes	Thermo Scientific	101R20
TBS	Merck	T5912	10x, solution
Triton-X100	Merck	T8787
Tryptone	Merck	93657
Tween20	Merck	P1379
Vortex-Genie 2 Mixer	Merck	Z258423
X-gal	Merck	XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells	Stratagene	#200236
Yeast extract	Merck	Y1625