Engenharia de Agentes Antivirais via Ressonância de Plasmon de Superfície
Summary
O presente protocolo descreve novas ferramentas para ensaios de ligação ao SPR para examinar a ligação de CV-N ao AH, glicoproteína S, glicanos do tipo híbrido relacionados e oligossacarídeos com alto teor de manose. O SPR é usado para determinar o KD para ligar o CV-N dimérico ou monomérico a esses glicanos.
Abstract
A ressonância plasmônica de superfície (SPR) é usada para medir a ligação da hemaglutinina (HA) ao dímero de cianovirina-N (CV-N) trocado por domínio e para monitorar interações entre peptídeos manosilados e o local de ligação de alta afinidade do CV-N. Foram relatados picos de envelope de vírus gp120, HA e glicoproteína (GP) de Ebola (GP) 1,2 para se ligar a locais de ligação de alta e baixa afinidade na CVN2 dimérica. O peptídeo HA dimanosilado também está ligado nos dois locais de ligação de baixa afinidade a uma molécula modificada de CVN2, que está carregando um local de alta afinidade para o respectivo ligante e mutado para substituir uma ligação dissulfeto estabilizadora na bolsa de ligação de carboidratos, confirmando assim a ligação multivalente. A ligação ao AH é mostrada a um local de ligação de alta afinidade do pseudo-anticorpo CVN2 em uma constante de dissociação (KD) de 275 nM que neutraliza ainda mais o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) através da oligomerização. A correlação do número de pontes dissulfeto na CVN2 trocada por domínio, que é diminuída de 4 para 2 pela substituição de cistinas em pares de resíduos polares de ácido glutâmico e arginina, resulta em afinidade de ligação reduzida ao AH. Entre as interações mais fortes, o Ebola GP1,2 é ligado por CVN2 com dois locais de ligação de alta afinidade na faixa nanomolar inferior usando o glicano de envelope sem um domínio transmembrana. No presente estudo, a ligação da glicoproteína spike (S) monomérica multiespecífica CV-N à glicoproteína spike (S) do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) é medida em K D = 18,6 μM em comparação com a KD nanomolar para esses outros picos de vírus, e através de seu domínio de ligação ao receptor na faixa μ molar média.
Introduction
A atividade antiviral associada à tetherin é induzida por α interferon, e compreende amarras à base de proteínas, que levam à retenção de virions totalmente formados em superfícies celulares infectadas1. A necessidade de glicosilação por amarrina na inibição da liberação do vírus permanece incerta, implicando a importância dos padrões de glicosilação em glicanos expressos recombinantemente para estudos in vitro 1,2, o que depende da conformação de (no caso do vírus da gripe) hemaglutinina da gripe expressa superficialmente 3,4 . Observou-se que a modificação do oligossacarídeo amarrado à glicosilação ligada a N é suficiente para a restrição mediada por teia da liberação do HIV tipo 12, enquanto a dimerização desempenha um papel essencial na prevenção da liberação do vírus, envolvendo assim o domínio transmembrana ou a âncora glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) para amarrar os virions em brotamento5 . Características exclusivas são descritas para a amarrina humana e murina para bloquear vários vírus envelopados, retrovírus e filovírus. A BST-2/tetherin é uma proteína antiviral induzível por interferon da imunidade inata1,6, atuando com atividade antiviral de amplo espectro e é antagonizada pelas glicoproteínasdo envelope 5 para translocar a tetherin ou interromper a estrutura da tetherin 6. Por exemplo, a glicoproteína HA do envelope expresso superficialmente e a neuraminidase no vírus influenza A são bem conhecidas pelo antagonismo da teina de maneira específica da cepa7, facilitando o reconhecimento dos locais de ligação do receptor hospedeiro8. Os anticorpos direcionados ao glicano são estudados na estequiometria de suas interações com os escudos glicanos de rápida personalização no AH, resultando em afinidade de ligação aos subtipos 4 H3N2 e H1N1da influenza A.
Para elucidar os mecanismos de ligação entre agentes antivirais e picos de envelope de vírus, ou seja, ligantes de carboidratos e métodos imunológicos e espectroscópicos complementares, metades mono, di- e tri-manose são sintetizadas quimicamente. Os peptídeos manosilados, são criados via glicosilação azida de glicosil {beta}-peracetato para a transformação de azidas de glicosila 1,2-trans9, imitando a N-acetilglucosamina tipicamente encontrada e oligossacarídeos de alto manose na superfície de vírus com risco de vida. Os bioisósteros triazólicos são utilizados para imitar ligações que formam o resíduo manosilado do peptídeo HA10 e facilitar interações site-specific com derivados antivirais CV-N em torno do segundo ponto de glicosilação ligado a N no domínio da cabeça de AH (topo de AH com 4 glicanos ligados a N N54, N97, N181, N301)8,11,12 . As interações entre o ácido glutâmico (Glu) e a arginina (Arg) e o dipolo de hélice resultante manifestaram boa estabilidade de ambos os peptídeos modelo e proteínas, mas são visualizadas usando SPR. Se comparado com o reconhecimento de um único sítio de glicosilação quimicamente sintetizado no HA10, inibindo diretamente a ligação do receptor nas metades de glicano, uma maior afinidade de uma estrutura Fc mutada de quatro locais ao seu receptor é mostrada para provocar funções efetoras in vivo, revelando a composição não relacionada de glicanos ligados a N ligados ao mutante Fc a ser determinada mecanicamente13.
O CV-N apresenta atividade antiviral contra o HIV 14,15, influenza16 e vírus Ebola, que é mediada pela ligação nanomolar a modificações de oligossacarídeos de alta manose em proteínas spike do envelope12,17,18,19. Determina-se que a ligação do AH influenza a um sítio de ligação a carboidratos (H) de alta afinidade em CV-N ou dois Hs em CVN2 dimérico covalentemente ligado tem constantes de dissociação de equilíbrio (K D) = 5,7 nM (Figura 1A) e KD = 2,7 nM, respectivamente. Tanto o CV-N quanto o CVN2 abrigam outro um ou dois sítios de ligação a carboidratos (L) de baixa afinidade 12,17,20,21. O Ebola GP1,2 liga-se a 2H de CVN2 com afinidades na faixa nanomolar inferior (KD = 26 nM). A CV-N WT vinculando-se ao Ebola GP1,2 e HA apresenta afinidades de K D = 34 nM a KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. As lectinas, como a CV-N, que visam especificamente glicanos de alta manose nos envelopes virais, inibem ainda mais a replicação do vírus da hepatite C, SARS-CoV, herpesvírus, vírus de Marburg e vírus do sarampo22.
A pequena molécula CV-N tem sido estudada minuciosamente há mais de 20 anos, pois se funcionaliza para se ligar a uma ampla gama de vírus para inibir a entrada viral16,18. Análises estruturais e ensaios de afinidade de ligação indicam reticulação de dois Ls em um dímero CVN2 trocado por domínio por ligação bivalente na faixa micromolar para aumentar a avidez às glicoproteínas do envelope viral10,19. A ligação seletiva de Manα1-2Manα nos braços D1D3 de Man(8) e Man(9) compreende dois locais de ligação de diferentes afinidades localizados em protômeros de proteínas opostas20, alcançando, assim, afinidades de ligação nanomolar (Figura 1B). Assim, o CVN2 é considerado um pseudo-anticorpo quanto à sua aplicação para ligar epítopos na gp120 do HIV, semelhante aos anticorpos neutralizantes do vírus17. Neste documento, o autor está interessado em investigar a potencial ligação do CVN2 ao pico do SARS-CoV-2 através do seu domínio de ligação ao receptor (RBD). Curvas de ligação da enzima conversora de angiotensina humana imobilizada (ECA)-2 com o SARS-CoV-2 RBD resultam em KD = 4,7 nM para essa interação de ligação biologicamente relevante23.
Por outro lado, classes selecionadas de imunoglobulinas reconhecem padrões proteicos estruturais específicos e consistentes, que conferem um substrato para a maturação por afinidade nas regiões de AH ancoradas na membrana24. O CV-N mostra atividade altamente potente em quase todos os vírus influenza A e B16, sendo um agente antiviral amplamente neutralizante. Nosso conhecimento é incompleto sobre a localização de epítopos direcionados no caule de HA1 e HA2 que possivelmente envolvem estruturas epitópicas para direcionamento de glicano por anticorpos altamente neutralizantes e em comparação com a ligação àlectina 25.
Figura 1: Representação esquemática do ensaio de ligação SPR para CV-N a espículas de envelope de vírus. (A) Ensaio SPR para ligação de CV-N ao ligante: proteína de comprimento total HA (90 kDa). Conjunto de dados cinéticos (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) mostrando ligação duplamente referenciada em tempo real à influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) Ligação da variante V2 do CVN2L0 ao ligante imobilizado DM dentro de uma faixa de concentração de 500 nM a 16 μM. Sequência: Os resíduos de L são destacados em amarelo. Os resíduos de H são destacados em cinza. E58 e R73 são um substituto para cisteínas na proteína selvagem e fazem da V2 uma dobra proteica estável com três em vez de quatro ligações dissulfeto Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Enquanto o escudo glicano na parte superior do AH membrana-distal induz uma ligação de alta afinidade ao CV-N 12, a ligação do CVN2 ao AH adjacente a uma ponte dissulfeto da parte superior do AH tem sido observada em seus locais de baixa afinidade10,12. Várias interações polares e locais de interação são identificados na ligação a carboidratos pelo CV-N. Essas interações são verificadas por meio da geração de variantes knock-out no sítio de ligação para correlacionar afinidades de ligação com a glicosilação predita in silico 12. Assim, o projeto visa comparar peptídeos HA quimicamente manosilados previamente testados em afinidade e especificidade de ligação com sequências peptídicas curtas de picos de 2019-nCoV relacionados ao SARS e SARS-CoV-2, ocorrendo naturalmente modificados por um pequeno número de diferentes locais de glicosilação ligados a N e glicosilação ligada a O. Usando microscopia crioeletrônica e ensaios de ligação, Pinto e colaboradores relatam um anticorpo monoclonal, S309, que potencialmente reconhece um epítopo na proteína spike SARS-CoV-2 contendo um glicano conservado dentro do subgênero Sarbecovirus, sem competir com a ligação do receptor26. O protocolo deste estudo descreve como projetar, expressar e caracterizar variantes de CV-N são importantes para estudar como CV-N e CVN2 se ligam a proteínas glicosiladas e peptídeos manosilados sintéticos utilizando a tecnologia SPR10,12.
O dímero ligado a tandem CVN2L027 e as variantes de local de ligação (V2-V5) são expressas de forma recombinante e as variantes estão com substituições de ligação dissulfeto (C58E e C73R) (Figura 2A). Além disso, um mutante com uma mutação de ponto único E41A é preparado porque esta posição tem sido vista como um resíduo de contato cruzado intermolecular. Este mutante é outra molécula interessante para medições de ligação SPR entre a lectina e oligossacarídeos de alta manose decifrando domínios de ligação e permite a comparação com a forma dimérica. A estrutura cristalina trocada por domínio do CVN2 mostra um ligador flexível, que se estende entre 49 e 54 resíduos. Os dois domínios podem continuar se movendo ao redor da dobradiça como corpos rígidos, desenvolvendo um monômero através de interações de domínio intramolecular (domínio A -resíduos 1-39;90-101- com domínio B -resíduos 40-89) ou um dímero por troca de domínio intermolecular [domínio A (do primeiro monômero) com domínio B (do segundo) e domínio B (do primeiro monômero) com domínio A (da segunda cópia)]. Não há interações próximas entre os domínios A e B dos dois protômeros, com exceção de Glu4128. O gene para CV-N pode ser desenvolvido usando um método de PCR repetitivo com oligossintetizados 40-mer 29 e é então subclonado nos sítios NdeI e BamHI de pET11a para transformação (eletroporação) em células eletrocompetentes, conforme descrito por Keeffe, J.R.27. A proteína, que é usada para alcançar a respectiva estrutura cristalina (PDB ID 3S3Y), inclui uma etiqueta de purificação N-terminal de 6 histidinas seguida por um local de clivagem da protease do Fator Xa. A mutagênese dirigida ao local é utilizada para fazer mutações pontuais, alternar códons e inserir ou excluir bases ou códons únicos ou múltiplos para troca de aminoácidos. Essas transformações fornecem informações inestimáveis sobre a função e a estrutura das proteínas. CV-N, CVN2 e CVN3 recombinantemente expressos e purificados têm sido biofisicamente bem estudados20,21,27, são de baixa produção e, portanto, utilizados para caracterizar ensaios de ligação a glicanos imobilizados em chips de sensor SPR. O ensaio imunoenzimático convencional (ELISA) fornece menor reprodutibilidade em relação à técnica de imobilização de ligantes de glicano e transforma a ligação em tempo real de várias variantes do local de ligação, o que é mostrado para SPR, em ensaios de desfecho.
A variante de afinidade de ligação CVN2L0-V2 (uma dobra intacta de CV-N homodimérico com uma substituição de ponte dissulfeto10) é expressa com uma etiqueta His-em Escherichia coli (E. coli), purificada sobre a coluna Ni-NTA aplicando cromatografia de afinidade e testada quanto à ligação a HA (H3N2), peptídeo HA monomanisílico e peptídeo HA dimanosilado usando SPR. Peptídeos quimicamente manosilados, ou proteínas HA e S, todos são ligantes e amina acoplados à superfície do chip hidrofílico através de ésteres reativos ou engenharia de proteínas de biotina-estreptavidina. O mesmo procedimento de corridas sequenciais é aplicado a esses ligantes, injetando várias diluições de CV-N e variantes de CV-N (e CVN2) para obter informações cinéticas para as análises de interação molecular, conforme descrito abaixo30. O chip sensor SPR imobilizado por RBD é usado para estudos de ligação de peptídeos CV-N a S, e as afinidades são comparadas à ligação do SARS-CoV-2 com a ACE2 humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
A afinidade de ligação do CV-N está correlacionada com o número de sites de ligação funcionais [2H nos domínios B e 2L no(s) domínio(s) A, quando projetados como dímero trocado por domínio]. Uma variante com uma afinidade de ligação alterada (CVN2L0-V2, uma prega estável homodimérica de CV-N compreendendo um knock-out de ponte dissulfeto) é expressa em E. coli, purificada e testada positivamente para ligação à proteína HA (H3N2) usando SPR10, e mostra uma mudança confo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autor reconhece o Dr. Christian Derntl do Departamento de Biotecnologia e Microbiologia da TU Wien e do Departamento de Medicina III, Divisão de Nefrologia e Diálise da Universidade Médica de Viena, especialmente o Dr. Markus Wahrmann para apoio técnico e científico. A expressão de proteínas em células de mamíferos foi apoiada pelo Departamento de Biotecnologia da Universidade de Recursos Naturais e Ciências da Vida (BOKU) de Viena. A autora quer expressar seu profundo reconhecimento ao Dr. Nico Dankbar, da XanTec bioanalytics em Duesseldorf, Alemanha, por discussões científicas úteis sobre a realização dos ensaios de vinculação SPR.
Materials
| Äkta primeplus | Cytiva | ||
| Amicon tubes | Merck | C7715 | |
| Ampillicin | Sigma-Aldrich | A5354 | |
| Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B06320 | |
| Cell spreader | Sigma-Aldrich | HS86655 | silver stainless steel, bar L 33 mm |
| Custom DNA Oligos | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
| Custom Gensynthesis | GenScript | #1390661 | cloning vector: pET27b(+) |
| Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
| Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
| Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
| DTT | Merck | DTT-RO | |
| EDC | Merck | 39391 | |
| EDTA | Merck | E9884 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
| Ethanol | Merck | 51976 | |
| Ethanolamine HCl | Merck | E6133 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack | Corning | 352057 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| Glycine HCl | Merck | 55097 | |
| HA H3 protein | Abcam | ab69751 | |
| HEPES | Merck | H3375 | |
| His-select Ni2+ | Merck | H0537 | |
| Imidazole | Merck | I2399 | |
| IPTG | Merck | I6758 | |
| Kanamycin A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
| LB agar | Merck | 52062 | |
| LB agar | Merck | 19344 | |
| LB Lennox | Merck | L3022 | |
| Lysozyme | Merck | 10837059001 | |
| Magnesium chloride | Merck | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Merck | M7506 | |
| NaH2P04 | Merck | S0751 | |
| NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| NaOH | Merck | S5881 | |
| NHS | Merck | 130672 | |
| NZ amine (casein hydrolysate) | Merck | C0626 | |
| PBS | Merck | 806552 | |
| PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
| Peptone | Merck | 70171 | |
| pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
| Reichert Software Package Autolink1-1-9 | Reichert | ||
| Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System | Reichert | ||
| Scrubber2-2012-09-04 for data analysis | Reichert | ||
| SDS | Merck | 11667289001 | |
| Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid | Stratagene | #200518 | |
| Sodim chloride | Merck | S9888 | |
| Sodium acetate.Trihydrate | Merck | 236500 | |
| SPR sensor chip C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
| SPR sensor chip CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
| Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Scientific | 101R20 | |
| TBS | Merck | T5912 | 10x, solution |
| Triton-X100 | Merck | T8787 | |
| Tryptone | Merck | 93657 | |
| Tween20 | Merck | P1379 | |
| Vortex-Genie 2 Mixer | Merck | Z258423 | |
| X-gal | Merck | XGAL-RO | |
| XL1-Blue Supercompetent Cells | Stratagene | #200236 | |
| Yeast extract | Merck | Y1625 |
References
- Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
- Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26 (2018).
- Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
- Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
- Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
- Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
- Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
- Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
- Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
- Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
- Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
- Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621 (2021).
- Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
- Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
- Bolmstedt, A. J., O’Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
- O’Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
- Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
- Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
- Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
- Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
- Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
- Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
- Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
- Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
- Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
- Fischer, M. J. E., Mol, N., Fischer, M. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 627, (2010).
- Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , 532-535 (2005).
- . QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to (2005)
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- . Expasy.org Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022)
- Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
- Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
- . Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28 Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022)
- Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. 5, 97-141 (2007).
- . Method Development Notes Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022)
- Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
- Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
- Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).
