Summary
Il presente protocollo dimostra i diversi passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. Le cornee rigeneranti o completamente restaurate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari seguendo la procedura di ferita.
Abstract
Le ferite corneali embrionali di pulcino mostrano una notevole capacità di rigenerarsi completamente e rapidamente, mentre le cornee ferite adulte sperimentano una perdita di trasparenza a causa di cicatrici fibrotiche. L'integrità tissutale delle cornee embrionali danneggiate viene intrinsecamente ripristinata senza formazione di cicatrici rilevabili. Data la sua accessibilità e facilità di manipolazione, l'embrione di pulcino è un modello ideale per studiare la riparazione della ferita corneale senza cicatrici. Questo protocollo dimostra i diversi passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. In primo luogo, le uova vengono finestre in età embrionale precoce per accedere all'occhio. In secondo luogo, una serie di manipolazioni fisiche in ovo alle membrane extraembrionali sono condotte per garantire che l'accesso all'occhio sia mantenuto attraverso le fasi successive dello sviluppo, corrispondenti a quando si formano i tre strati cellulari della cornea. In terzo luogo, le ferite corneali lineari che penetrano nello strato epiteliale esterno e nello stroma anteriore sono realizzate utilizzando un coltello microchirurgico. Il processo di rigenerazione o le cornee completamente ripristinate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari dopo la procedura di ferita. Studi condotti finora con questo modello hanno rivelato che le cornee embrionali ferite mostrano l'attivazione della differenziazione dei cheratociti, subiscono un rimodellamento coordinato delle proteine ECM alla loro macrostruttura tridimensionale nativa e diventano adeguatamente innervate dai nervi sensoriali corneali. In futuro, il potenziale impatto di fattori endogeni o esogeni sul processo rigenerativo potrebbe essere analizzato nella guarigione delle cornee utilizzando tecniche di biologia dello sviluppo, come l'innesto di tessuto, l'elettroporazione, l'infezione retrovirale o l'impianto di perline. L'attuale strategia identifica il pulcino embrionale come un paradigma sperimentale cruciale per chiarire i fattori molecolari e cellulari che coordinano la guarigione delle ferite corneali senza cicatrici.
Introduction
La cornea è il tessuto trasparente più esterno dell'occhio che trasmette e rifrange la luce favorevole all'acuità visiva. Nella cornea adulta, il danno o l'infezione allo stroma corneale porta a una risposta di guarigione delle ferite rapida e robusta caratterizzata da proliferazione dei cheratociti, fibrosi, aumento dell'infiammazione che porta ad apoptosi indotta da citochine, generazione di miofibroblasti di riparazione e rimodellamento generale della matrice extracellulare (ECM)1,2 . A seguito di lesioni, tale riparazione del tessuto corneale si traduce in tessuto cicatriziale opaco che riduce la trasparenza corneale e occlude il passaggio della luce, distorcendo così la visione e, nei casi più gravi, portando alla cecità corneale3. Pertanto, vi è una chiara necessità di sviluppare modelli animali affidabili per affrontare le complessità della guarigione delle ferite e identificare i fattori cellulari e molecolari responsabili della chiusura delle ferite e della rigenerazione dei tessuti.
Ad oggi, la maggior parte degli studi che esaminano la guarigione delle ferite corneali hanno utilizzato modelli animali post-natali4 o adulti 1,2,5,6,7. Mentre questi studi hanno portato a un significativo progresso nella comprensione della risposta di guarigione delle ferite corneali e dei meccanismi alla base della formazione di cicatrici, i tessuti corneali danneggiati in questi modelli di guarigione non riescono a rigenerarsi completamente, limitando così la loro utilità per identificare i fattori molecolari e i meccanismi cellulari responsabili della completa ricapitolazione della morfologia corneale e della struttura post-lesione. Al contrario, le ferite fetali generate con un coltello nella cornea embrionale del pulcino possiedono una capacità intrinseca di guarire completamente in modo senza cicatrici8. In particolare, la cornea embrionale del pulcino mostra una rigenerazione non fibrosa con la completa ricapitolazione della struttura della matrice extracellulare e dei modelli di innervazione 8,9.
Il presente protocollo descrive una sequenza di passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. In primo luogo, le uova vengono finestrate in età embrionale precoce per facilitare l'accesso all'embrione. In secondo luogo, una serie di manipolazioni fisiche in ovo alle membrane extraembrionali sono condotte per garantire che l'accesso all'occhio sia mantenuto attraverso le fasi successive dello sviluppo, corrispondenti a quando si formano i tre strati cellulari della cornea e si desidera la ferita. In terzo luogo, le incisioni lineari della cornea centrale che penetrano attraverso l'epitelio corneale e nello stroma anteriore sono fatte usando un coltello microchirurgico. Il processo di rigenerazione o le cornee completamente ripristinate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari dopo la procedura di ferita.
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Protocol
Il ceppo di uova utilizzato in questo protocollo era White Leghorn e tutte le procedure animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Illinois Wesleyan University.
1. Incubazione di uova di pulcino
- Mantenere le uova a ~ 10 ° C per un massimo di 1 settimana dopo che sono state deposte per arrestare lo sviluppo. Quando sei pronto per iniziare lo sviluppo dell'embrione di pulcino, pulisci l'intero guscio d'uovo con salviette prive di lanugine (vedi Tabella dei materiali) sature di acqua a temperatura ambiente per rimuovere sporco e detriti.
- Assicurarsi che il guscio d'uovo sia igienizzato. Pulire l'intera superficie dell'uovo con salviette prive di lanugine inumidite con etanolo al 70%. Pulire rapidamente l'etanolo per asciugare l'uovo ed evitare l'assorbimento di etanolo attraverso il guscio d'uovo all'embrione.
- Disporre le uova orizzontalmente su un vassoio. Segna la parte superiore dell'uovo per indicare la posizione prevista dell'embrione. Incubare le uova orizzontalmente, attivata la funzione di dondolo, in un incubatore umidificato a 38 °C.
2. Finestre delle uova per prepararsi alla dissezione della membrana
- Rimuovere le uova dall'incubatrice il terzo giorno di sviluppo embrionale (E3). Sterilizzare la parte superiore delle uova con salviette prive di lanugine inumidite con etanolo al 70%. Asciugare l'etanolo dalle superfici del guscio d'uovo.
NOTA: Per garantire che lo sviluppo non sia stato ritardato durante la procedura di finestratura, sono state rimosse 6-12 uova e la procedura è stata eseguita rapidamente su queste mentre le uova rimanenti sono state lasciate nell'incubatrice. - Posizionare un uovo orizzontalmente in un portauova sicuro (vedere Tabella dei materiali). Usando l'estremità affilata delle forbici di dissezione, crea un piccolo foro nella parte superiore del guscio d'uovo vicino all'estremità appuntita dell'uovo.
NOTA: Questo foro faciliterà la rimozione dell'albume, che è necessario per far cadere il tuorlo e l'embrione lontano dalla superficie interna del guscio d'uovo. Per i portauova sono stati utilizzati piatti di riempimento delle uova di pasta di carta, all'interno dei quali le uova vengono spedite. - Attraverso il foro (passo 2.2.), inserire un ago ipodermico smussato da 18 G. Con l'ago spinto sulla superficie interna inferiore dell'uovo e il lato smussato dell'ago rivolto verso l'estremità appuntita dell'uovo (ad esempio, lontano dalla posizione prevista del tuorlo e dell'embrione vicino al centro dell'uovo), rimuovere 2-3 ml di albume dall'uovo di gallina e scartare.
NOTA: Se l'ago colpisce l'embrione o la sua vascolarizzazione associata durante questa fase, si tradurrà in sangue aspirato con l'albume. Ciò comporterà la morte dell'embrione. Inoltre, se il tuorlo viene inavvertitamente aspirato insieme all'albume durante questa fase, l'embrione non sarà vitale. In entrambi i casi, l'uovo deve essere scartato se l'embrione non può essere immediatamente utilizzato per altri scopi. - Pulire la superficie del guscio d'uovo che circonda il foro con salviette prive di lanugine leggermente inumidite con etanolo al 70% e asciugare. Sigillare il foro fatto per rimuovere l'albume con nastro trasparente.
- Con l'estremità affilata delle forbici di dissezione, fare un secondo foro "finestra" nella parte superiore del guscio d'uovo nel sito di marcatura (Passo 1.3.). Assicurarsi che le forbici non si estendano troppo lontano nel guscio d'uovo per evitare di contattare e danneggiare l'embrione o la vascolarizzazione embrionale, che spesso sarà posizionata all'interno dell'uovo direttamente sotto il sito del secondo foro.
- Usando una pinza dell'iride curva, allarga il foro della "finestra" per estendersi di ~ 2-3 cm di diametro e fungere da "finestra" per l'embrione in via di sviluppo sotto il guscio.
- Inserire un'estremità della pinza nel foro, mantenendola parallela e strettamente giustapposta al guscio d'uovo. Con l'altra estremità della pinza posizionata all'esterno del guscio d'uovo, pizzicare con cura le due estremità della pinza insieme, permettendo loro di rompere e rimuovere piccoli pezzi del guscio d'uovo. Continuare a rompere e rimuovere i frammenti di guscio d'uovo fino a quando rimane una finestra di 2-3 cm che si sovrappone direttamente all'embrione.
NOTA: Uova in cui gli embrioni non giacciono direttamente sotto il foro fatto nella fase 2.6. non deve essere usato in quanto le prossime dissezioni a membrana sarebbero difficili da completare. Anche con la rotazione orizzontale delle uova, circa il 10% delle uova è inutilizzabile a causa dello scarso posizionamento dell'embrione. Questi embrioni possono essere utilizzati per altri scopi.
- Inserire un'estremità della pinza nel foro, mantenendola parallela e strettamente giustapposta al guscio d'uovo. Con l'altra estremità della pinza posizionata all'esterno del guscio d'uovo, pizzicare con cura le due estremità della pinza insieme, permettendo loro di rompere e rimuovere piccoli pezzi del guscio d'uovo. Continuare a rompere e rimuovere i frammenti di guscio d'uovo fino a quando rimane una finestra di 2-3 cm che si sovrappone direttamente all'embrione.
- Per limitare la contaminazione batterica, aggiungere attraverso il foro della finestra (ad esempio, nell'uovo) ~ 100-200 μL di soluzione di Ringer (8 g di NaCl, 0,37 g di KCl e 0,23 g diCaCl 2,2H 20 per L di H20 distillato) contenente antibiotici Penicillina/Streptomicina (50 U/mL di Penicillina e 50 μg/mL di Streptomicina, vedi Tabella dei materiali).
- Sigillare il foro della finestra con nastro adesivo trasparente. Eseguire la sigillatura dell'uovo allineando un angolo del nastro sull'asse lungo del foro e premendo il nastro sul guscio a ~ 1-2 cm di distanza dal bordo del foro.
- Continuare a sigillare intorno all'apertura fino a quando un lembo di nastro adesivo appeso viene lasciato su un lato. Premere i due pezzi di nastro insieme, creando una forma a cupola sopra il foro, e premere il lembo di nastro adesivo sul guscio per finire di sigillare l'uovo.
NOTA: le uova devono essere posizionate all'E2 o all'E3. Secondo l'esperienza, la finestra prima di E2 si traduce in una bassa vitalità embrionale. Inoltre, con E4, l'embrione e le membrane extraembrionali si attaccano al guscio d'uovo10, e qualsiasi tentativo di finestra a E4 o successivamente spesso provoca danni all'embrione o lacerazione dei vasi sanguigni extraembrionali, con entrambi gli eventi che portano all'esito della morte dell'embrione.
- Continuare a sigillare intorno all'apertura fino a quando un lembo di nastro adesivo appeso viene lasciato su un lato. Premere i due pezzi di nastro insieme, creando una forma a cupola sopra il foro, e premere il lembo di nastro adesivo sul guscio per finire di sigillare l'uovo.
- Restituire le uova "finestrate" all'incubatrice per un ulteriore sviluppo. Assicurarsi di mantenere le uova orizzontali e disattivare la funzione di oscillazione dell'incubatrice.
- Ripetere i passaggi 2.2.-2.9. per ogni uovo.
3. Microdissezioni delle membrane extraembrionali
- Rimuovere un uovo finestrato E5.5 dall'incubatrice. Esporre l'embrione tagliando il nastro lontano dalla finestra con forbici da dissezione sterilizzate.
- Utilizzare un microscopio di dissezione per osservare l'embrione e le sue membrane extraembrionali attraverso la finestra. Se necessario, utilizzare forbici o pinze di iride curva per allargare la finestra in modo che l'embrione sia ben posizionato sotto la finestra, facendo attenzione a non danneggiare la vascolarizzazione embrionale.
- Aggiungere due gocce di soluzione di Ringer contenente antibiotici Penicillina/Streptomicina per idratare l'embrione e sterilizzare l'uovo.
- Utilizzare un microscopio di dissezione per garantire che l'embrione sia nella fase di sviluppo corretta (stadio hamburger Hamilton 27, ~ E5.5) 11,12 e individuare le posizioni della membrana amniocorionica (ACM) e della membrana corioallantoica (CAM).
NOTA: In questa fase, l'embrione è circondato dall'ACM, che comprende la membrana amniotica e la membrana corionica sovrastante fusa e parzialmente coperta dall'allantoide altamente vascolarizzata, che si estende dalla regione intestinale dell'embrione e si fonde con il corion sovrapposto per formare il CAM11,12. L'ACM non è fortemente vascolarizzato, il che consente di sezionare queste membrane per esporre l'embrione senza danneggiare i vasi sanguigni e danneggiare l'embrione. - Eseguire dissezioni extraembrionali della membrana in questa fase (E5.5).
NOTA: E5.5 è il momento ideale per eseguire le dissezioni extraembrionali della membrana. Sezionare le membrane prima (ad esempio, a E4) prima della formazione di CAM riduce l'accessibilità dell'embrione nelle fasi successive11. Inoltre, a E5.5, l'embrione è solo parzialmente coperto dalla CAM altamente vascolarizzata, ma nei prossimi 1-2 giorni, la CAM avvolge rapidamente e preclude ulteriormente l'accesso all'embrione11,12. Per questo motivo, la dissezione della membrana a E6 o successivamente è difficile in quanto aumenta il rischio di lacerazione dei vasi sanguigni.- Utilizzare un paio di pinze sottili sterilizzate per afferrare delicatamente l'ACM e allontanarlo dall'embrione. Quindi utilizzare forbici micro-dissezionanti sterilizzate per tagliare un foro nell'ACM direttamente sopra l'arto anteriore che si estende dalla membrana sovrastante l'arto anteriore alla membrana sovrastante la testa.
NOTA: Questo passaggio rilassa le membrane di corione e amnione, rendendole così più facili da afferrare e sezionare ulteriormente con una pinza nei passaggi successivi. Vedere la Figura 1 per uno schema utile di come le membrane vengono sezionate attraverso la finestra del guscio d'uovo.
- Utilizzare un paio di pinze sottili sterilizzate per afferrare delicatamente l'ACM e allontanarlo dall'embrione. Quindi utilizzare forbici micro-dissezionanti sterilizzate per tagliare un foro nell'ACM direttamente sopra l'arto anteriore che si estende dalla membrana sovrastante l'arto anteriore alla membrana sovrastante la testa.
- Utilizzare due paia di pinze sottili e sterili per afferrare delicatamente l'amnione in due posizioni adiacenti tra l'ACM e il CAM (ad esempio, un'area tra il taglio effettuato sopra l'arto anteriore e il bordo più vicino del CAM).
- Muovi con attenzione ogni coppia di pinze, entrambe afferrando saldamente la membrana amniotica, lontano l'una dall'altra, con una coppia che si muove dorsalmente verso l'embrione e l'altra ventralmente.
NOTA: Questo movimento serve a strappare ulteriormente l'amnione mentre separa anche l'ACM (che viene tirato nella direzione dorsale rispetto all'embrione da un paio di pinze) e il CAM (che viene tirato nella direzione ventrale rispetto all'embrione dall'altra coppia di pinze). - Assicurarsi che le membrane siano separate quando la CAM non copre più l'embrione e l'arteria allantoica e la vena, che emanano dall'intestino embrionale alla CAM, sono immediatamente evidenti.
- Muovi con attenzione ogni coppia di pinze, entrambe afferrando saldamente la membrana amniotica, lontano l'una dall'altra, con una coppia che si muove dorsalmente verso l'embrione e l'altra ventralmente.
- Utilizzare pinze sottili sterilizzate per sezionare e rimuovere qualsiasi membrana di amnione rimanente che copre l'embrione. Si osserva più comunemente che l'amnione rimanente coprirà parzialmente la metà caudale dell'embrione.
- Usando una pinza sterilizzata, afferrare l'amnione vicino alla regione cranica centrale dell'embrione e tirare con attenzione l'amnione in direzione caudale rispetto all'embrione verso il precedente CAM spostato. L'embrione sarà ora completamente esposto e l'ulteriore crescita della CAM avverrà principalmente lontano dall'embrione in via di sviluppo.
NOTA: Vedere la Figura 1 per uno schema utile su come apparirà l'embrione esposto dopo la dissezione della membrana. Inoltre, fare riferimento a un rapporto11 pubblicato in precedenza per utili diagrammi schematici dei passaggi 3.3.-3.6.
- Usando una pinza sterilizzata, afferrare l'amnione vicino alla regione cranica centrale dell'embrione e tirare con attenzione l'amnione in direzione caudale rispetto all'embrione verso il precedente CAM spostato. L'embrione sarà ora completamente esposto e l'ulteriore crescita della CAM avverrà principalmente lontano dall'embrione in via di sviluppo.
- Aggiungere alcune gocce di soluzione di Ringer contenente antibiotici Penicillina/ Streptomicina per idratare l'embrione e sterilizzare l'uovo.
- Richiudere il foro della finestra utilizzando del nastro trasparente, come descritto nel passaggio 2.8. Riportare l'uovo all'incubatrice per un ulteriore sviluppo, mantenendo l'uovo orizzontale e mantenendo inattivata la funzione di dondolo dell'incubatore.
- Ripetere i passaggi 3.1.-3.8. per ogni uovo.
NOTA: Le dissezioni extraembrionali della membrana a E5.5 sopra descritte consentiranno l'accesso all'embrione attraverso E7, che è quando la ferita può essere eseguita 8,9. Con E8, la continua crescita del tessuto CAM inizia a coprire la regione cranica dell'embrione, precludendo così un ulteriore accesso alla cornea. Se si desidera eseguire ferite in cornee E8-E9 più vecchie, è possibile riposizionare la CAM in crescita ventralmente rispetto all'embrione (Fase 3.10.). Se si desidera ferire a E7, Passo 3.10. non è necessario eseguire e si può procedere alla fase 4, ferita corneale. - Rimuovere un uovo E7 dall'incubatrice le cui membrane extraembrionali sono state precedentemente sezionate a E5.5 (Passi 3.1.-3.8.). Afferrare con pinze sterilizzate tutti i tessuti di membrana amnionica disponibili fusi al CAM e tirare delicatamente la membrana amnione lontano dalla regione cranica dell'embrione in direzione ventrale rispetto all'embrione.
NOTA: Poiché la membrana amnionica che viene spostata lontano dall'embrione è fusa al CAM, la CAM in crescita e altamente vascolarizzata seguirà la pinza che afferra l'amnione e si allontanerà dalla regione cranica. Ripeti questo passaggio ogni giorno per spostare continuamente la CAM lontano dall'embrione fino a quando l'embrione non è all'età desiderata per la ferita.
4. Lesioni corneali
- Ottenere un uovo dall'incubatrice per la ferita all'età embrionale desiderata, E7-E9. Esporre l'embrione tagliando il nastro lontano dalla finestra con forbici da dissezione sterilizzate. Aggiungere alcune gocce di soluzione di Ringer contenente antibiotici Penicillina/ Streptomicina per idratare l'embrione e sterilizzare l'uovo.
- Utilizzare un coltello micro-dissezione per fare un'incisione che attraversa l'estensione della cornea dell'occhio destro (a causa di come l'embrione depone nell'uovo, l'occhio sinistro non è accessibile ma può servire come controllo non ferito), che è parallelo e in linea con la fessura coroide (Figura 1). Il primo taglio attraverserà l'epitelio corneale.
- Utilizzare il coltello micro-dissezione per lacerare nuovamente la cornea nello stesso punto della prima incisione 2 volte di più (ad esempio, tre tagli totali, con taglio 2 e taglio 3 che si verificano insieme alla stessa posizione nella cornea come taglio 1) 11. La seconda lacerazione attraverserà la membrana basale e la terza penetrerà nello stroma anteriore.
NOTA: Se l'embrione si è depositato sotto la CAM sezionata, si può usare una pinza dell'iride curva sterilizzata per spostare con cura la testa da sotto la CAM. Posizionare la pinza dell'iride curva sotto la testa, entrando in contatto con il lato sinistro della testa. Cullare l'intera testa sopra una pinza dell'iride curva chiusa e sollevare delicatamente la testa intorno e sopra il CAM. Per aiutare con la vitalità, utilizzare una tecnica simile con la pinza dell'iride curva per infilare l'embrione sotto la CAM dopo l'intervento chirurgico per promuovere una corretta crescita della CAM.
- Utilizzare il coltello micro-dissezione per lacerare nuovamente la cornea nello stesso punto della prima incisione 2 volte di più (ad esempio, tre tagli totali, con taglio 2 e taglio 3 che si verificano insieme alla stessa posizione nella cornea come taglio 1) 11. La seconda lacerazione attraverserà la membrana basale e la terza penetrerà nello stroma anteriore.
- Aggiungere 3-4 gocce di soluzione di Ringer contenente antibiotici Penicillina/Streptomicina per idratare l'embrione e sterilizzare l'uovo.
- Risigillare il foro della finestra con nastro trasparente e tornare all'incubatrice, lasciando l'uovo orizzontale. Lasciare che l'embrione si sviluppi e la ferita corneale guarisca per il periodo desiderato (ad esempio, 0,5-11 giorni), quindi eutanasizzare umanamente l'embrione per decapitazione.
- Usa una pinza dell'iride curva per raccogliere l'occhio da un embrione eutanasizzato che galleggia in una capsula di Petri della soluzione salina di Ringer afferrando delicatamente l'occhio sul lato posteriore, dove l'occhio e il tessuto facciale si incontrano, e sollevando con cura l'intero occhio lontano e libero dal tessuto facciale.
- Utilizzare una pinza fine per praticare un piccolo foro (3-5 cm) nella parte posteriore di tutto l'occhio e fissare l'intero occhio in paraformaldeide al 4% a 4 °C durante la notte con lieve agitazione.
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Representative Results
A seguito della precedente dissezione dell'ACM e del CAM a E5.5 per esporre la regione cranica dell'embrione in via di sviluppo, una serie di lacerazioni che attraversavano la cornea centrale E7 è stata effettuata in ovo (Figura 1). Una ferita ideale per studiare la rigenerazione della cornea si verifica dopo tre lacerazioni, ciascuna effettuata nella stessa posizione della cornea. La prima lacerazione attraversa l'epitelio corneale, mentre la seconda e la terza lacerazione penetrano rispettivamente nella membrana basale sottostante e nello stroma anteriore. Per ottenere una ferita ideale, è fondamentale utilizzare un coltello da micro-dissezione affilato (vedi Tabella dei materiali) e applicare la giusta quantità di pressione mentre viene effettuata la lacerazione (Figura 2, vedi ferita ideale). L'applicazione di una pressione troppo bassa si tradurrà in una ferita superficiale che strappa l'epitelio corneale senza penetrare sufficientemente nello stroma anteriore (Figura 2, vedi ferita superficiale). Tuttavia, l'applicazione di troppa pressione si traduce in una ferita a piena estensione che penetra nell'intero stroma ed espone l'umore acqueo all'ambiente esterno (Figura 2, vedi ferita a piena estensione).
L'esecuzione delle corrette incisioni laceranti produce una ferita ideale (Figura 2) che inizialmente si allarga (0-3 giorni dopo la ferita)8 (Figura 3). È stato postulato che la fase di allargamento della ferita che si verifica ferendo le cornee di pollo E7 è correlata alla rapida espansione delle dimensioni dell'occhio in questo stadio embrionale8. Gli occhi di pollo embrionali crescono a un ritmo significativamente più veloce da E4 a E10 rispetto alla crescita dell'occhio da E10 alla schiusa. Queste prime fasi rapide della crescita oculare sono attribuite a una crescita elevata dipendente dalla pressione intraoculare (IOP)13. Pertanto, è probabile che il rapido tasso di crescita dell'occhio accoppiato con l'elevata IOP promuova la retrazione della ferita durante le prime fasi del processo di guarigione (0-3 giorni dopo la ferita), che è unico per la progressione della guarigione della ferita corneale embrionale. Successivamente, si verificano la riepitelizzazione e la formazione di nuovi tessuti (4-9 giorni dopo la ferita) per chiudere la ferita in modo privo di cicatrici entro 11 giorni dalla ferita8 (Figura 3A).
Un'ulteriore analisi della profondità e della rigenerazione della ferita è stata possibile colorando le sezioni trasversali con un anticorpo laminina che segna la membrana basale ricca di laminina e contro-macchiando le sezioni con il marcatore nucleare DAPI, che rivela l'estensione della ferita attraverso l'epitelio corneale8. Le cornee recentemente ferite (0 dpw) e quelle che sono all'inizio del processo di rigenerazione (3 dpw) hanno mostrato che la ferita penetrava nello strato epiteliale e nella membrana basale, come evidenziato dalla colorazione di effrazione del marcatore nucleare DAPI all'interno dell'epitelio corneale e dall'assenza di colorazione degli anticorpi laminina, che segna la membrana basale ricca di laminina tra l'epitelio corneale e lo stromasottostante 8 (Figura 3B ). Tuttavia, le sezioni trasversali attraverso 11 cornee dpw colorate con DAPI e anticorpo laminina hanno rivelato una cornea completamente guarita che era stata riepitelizzata e conteneva una membrana basale continua ricca di laminina nel sito della ferita rigenerata8 (Figura 3B).
Dopo l'incisione corneale, è stata effettuata una caratterizzazione dettagliata del processo di guarigione delle ferite eseguendo l'immunoistochimica su tessuti corneali feriti e sezionati. Le proteine della matrice extracellulare fibronectina e tenascina sono associate alla migrazione delle cellule epiteliali e cheratocitarie nella guarigione delle ferite corneali adulte14,15. La localizzazione spaziotemporale delle proteine della matrice extracellulare, della fibronectina e della tenascina è evidente all'interno della ferita di guarigione ed è risultata elevata nei punti temporali corrispondenti alla riepitelizzazione corneale (5 giorni dopo la ferita)8 (Figura 4). Tale analisi suggerisce l'importanza della fibronectina e della tenascina per la chiusura della ferita e, in particolare, il loro coinvolgimento nella migrazione e sopravvivenza delle cellule epiteliali, coerentemente con tali funzioni nelle ferite corneali adulte16,17.
A partire da E8-E9, la cornea diventa densamente innervata da fibre nervose sensoriali trigeminali che emanano da un anello nervoso pericorneale e attraversano lo stroma anteriore mentre si proiettano verso il centro della cornea e l'epitelio corneale da E12 18,19,20. Poiché le ferite corneali in questo modello sono fatte a E7, poco prima della proiezione del nervo nella cornea, questo modello indaga ulteriormente i nervi corneali mentre navigano in una cornea di guarigione dopo l'insulto. Utilizzando l'immunoistochimica a monte intero per tracciare i nervi corneali con anticorpi anti-β tubulina neurale (Tuj1)21, è evidente che i nervi sono temporaneamente inibiti dal tessuto corneale di guarigione che giustappone direttamente la cornea centrale ferita (5 giorni dopo la ferita)8 (Figura 5A,B). Nonostante la precedente inibizione, i nervi corneali alla fine innervano il tessuto corneale completamente guarito (11 giorni dopo la ferita) a livelli di densità simili e in modelli simili ai controlli non feriti abbinati allo stadio (E18C) (Figura 5C, D).
Sorprendentemente, i tessuti corneali completamente riepitelizzati che sono guariti in modo non fibrotico e senza cicatrici mostrano una completa ricapitolazione della normale architettura del tessuto di collagene. Come evidenziato dall'imaging armonico di seconda generazione22,23, fasci di fibre di collagene attraverso varie profondità dell'area della ferita corneale centrale sono disposti ortogonalmente, corrispondendo alla macrostruttura nativa del tessuto corneale centrale non ferito9 (Figura 6).
Figura 1: Schema delle dissezioni della membrana extraembrionale in ovo e delle ferite corneali. A E5.5, la regione cranica dell'embrione viene esposta sezionando le membrane ACM e CAM e posizionando l'amnione e l'allantoide lontano dall'occhio in via di sviluppo. Le uova vengono sigillate e incubate in E7 quando la cornea centrale viene ferita, usando una pinza curva come culla per la testa dell'embrione mentre la punta di un coltello microchirurgico fa un'incisione nella cornea centrale. La ferita è orientata parallelamente alla fessura coroide (asterisco). Per garantire che la profondità dell'incisione raggiunga lo stroma anteriore, è necessario eseguire tre tagli simultanei con il coltello, ciascuno nella stessa posizione relativa, uno sopra l'altro. Barra della scala = 1 mm. La figura è adattata con il permesso dei riferimenti 8,11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Variazioni nelle ferite generate in ovo. (A) A seguito di dissezioni di membrana a E5.5, l'occhio destro è accessibile in ovo. (B-D) Immagini scattate di un embrione in ovo immediatamente dopo lacerazioni di vario grado che coprono l'estensione della cornea e sono in linea con la fessura coroide (cf). (B) A seguito di tre lacerazioni in cui è stata applicata una debole pressione, è visibile una ferita poco profonda. La punta della freccia segna un sito nella cornea in cui l'epitelio è stato tranciato ma lo stroma anteriore non è stato penetrato. Le punte di freccia denotano una piccola regione corneale in cui è stato penetrato lo stroma anteriore. (C) Dopo tre lacerazioni in cui è stata applicata una quantità ideale di pressione, è visibile una ferita ideale. Le punte di freccia denotano una ferita che copre l'intera estensione della cornea in cui è stato penetrato lo stroma anteriore. (D) A seguito di tre lacerazioni in cui è stata applicata una pressione eccessiva, è visibile una ferita a tutta estensione e l'umore acqueo è stato esposto all'ambiente esterno. Abbreviazioni: tca, arteria ciliare temporale; cf, fessura coroide; CAM, membrana corioallantoica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Progressione della guarigione delle ferite. (A) La progressione della guarigione nelle cornee ferite rispetto ai controlli in stadio è mostrata dal momento della ferita (0 dpw) e 16 ore dopo la ferita (hrpw) fino a 3-11 giorni dopo la ferita (dpw). Le punte di freccia delineano i bordi dorsali e ventrali della ferita, indicando un periodo di espansione della ferita (0-3 dpw) seguito da una chiusura progressiva della ferita (5-11 dpw). (B) Cornee ferite daPI (blu) e laminina (rosse) sezionate a 0, 3 e 11 dpw. Le parentesi mostrano l'estensione della regione ferita, che rivela l'espansione della ferita di 3 dpw e la riparazione completa della cornea riepitelizzata da E11. Gli asterischi denotano la regione guarita della cornea. La barra della scala è (A) 1 mm, (B) 100 μm. La figura è adattata con il permesso del riferimento8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi istologica delle cornee ferite. Sezioni trasversali attraverso (A) 3 dpw e (B) 5 dpw. Le cornee ferite colorate di DAPI (blu) rivelano la localizzazione di fibronectina (FN, rosso) e Tenascin-C (TN-C, verde). Le parentesi in (A) e (B) indicano la regione ferita. Barra di scala: 100 μm. Abbreviazioni: ep, epitelio; st, stroma; it, endotelio. La figura è adattata con il permesso del riferimento8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Innervazione delle cornee ferite. (A-D) Visualizzazione dei nervi corneali a seguito di immunocolorazione anti-β tubulina neurale (Tuj1) a montaggio intero in (B) 5 dpw e (D) 11 dpw, nonché (A) controlli E12 (E12C, stage-matched per 5 dpw) e (C) E18 (E18C, stage-matched per 11 dpw). (B) La linea spezzata nella cornea a 5 dpw denota l'estensione della ferita. L'area tra parentesi direttamente adiacente alla ferita denota l'area corneale che è temporaneamente repulsiva ai nervi e attivamente sottoposta a riepitelizzazione. (B.) La scansione ottica attraverso il tessuto corneale di guarigione direttamente adiacente alla ferita aperta rivela un raro fascio nervoso stromale che si estende nel tessuto (freccia) e nei guinzagli nervosi epiteliali (punta di freccia). (C,D) Le cornee completamente rigenerate a 11 dpw mostrano modelli di innervazione simili e densità nervose comparabili ai controlli abbinati allo stadio. Abbreviazione: w, wound. La figura è adattata con il permesso del riferimento8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Ultrastruttura del collagene nelle cornee embrionali guarite. (A) Scansione del viso di cornee da 10 dpw completamente guarite e controlli in stadio abbinati utilizzando l'imaging armonico di seconda generazione (SGH). Le profondità di scansione variano da 2-66 μm dalla superficie anteriore della cornea (0 μm è lo stroma più anteriore) e sono elencate a sinistra delle rispettive immagini. Gli inserti per ogni immagine corrispondono all'analisi della trasformata di Fourier veloce dell'area centrale della ferita per quella particolare profondità di scansione. (B) Pile segmentate manualmente di analisi bidimensionale della trasformata di Fourier veloce, che rappresentano l'organizzazione del collagene all'interno della cornea di controllo ferita e abbinata allo stadio. Barra della scala = 50 μm. La figura è adattata con il permesso del riferimento9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il pulcino è un sistema modello ideale per studiare la riparazione della ferita corneale fetale e senza cicatrici. A differenza dei mammiferi, il pulcino è facilmente accessibile durante tutto lo sviluppo utilizzando le strategie ovo8 o ex ovo 24. La cornea embrionale del pulcino è molto più grande delle cornee dei roditori, con quasi il 50% del volume cranico dedicato all'occhio25, rendendolo altamente suscettibile di manipolazioni fisiche come le ferite. Inoltre, le uova di gallina sono prontamente disponibili tutto l'anno, spesso provenienti da allevamenti locali, e convenienti, richiedendo solo un incubatore umificato per sostenere lo sviluppo.
Questo protocollo riporta una serie di procedure che consentono la ferita della cornea del pulcino embrionale. Le ferite apportate alla cornea embrionale del pulcino si rigenerano completamente, consentendo una completa ricapitolazione della struttura corneale nativa senza cicatrici rilevabili. Questa tecnica ha reso il pulcino embrionale un modello animale vitale per chiarire i fattori molecolari e cellulari che coordinano la guarigione delle ferite corneali senza cicatrici.
Nonostante la chiara promessa inerente al modello di guarigione delle ferite fetali qui descritto, vale la pena notare che ci sono chiare differenze tra la guarigione delle ferite corneali fetali e adulte. La cornea embrionale esprime fattori di crescita e segnali morfogenetici che sono silenziati o assenti nei tessuti adulti26. Inoltre, i tessuti corneali adulti feriti presentano fibrosi e formano tessuto cicatriziale, probabilmente a causa di una maggiore risposta infiammatoria mediata da citochine e fattoridi crescita 27, che sono smorzati o non ancora stabiliti nelle fasi embrionali. Tali differenze legate all'età all'interno del tessuto corneale potrebbero complicare gli sforzi per ripristinare completamente il tessuto ferito adulto. Tuttavia, la determinazione dei fattori molecolari chiave e delle proteine della matrice che regolano la guarigione delle ferite senza cicatrici fetali aprirà la strada a terapie che promuovono un processo di guarigione più ristoratore con meno cicatrici e una migliore ricapitolazione della normale architettura tissutale.
Il metodo di ferimento qui descritto si basa su una tecnica sviluppata per la prima volta da Spurlin et al.11 per ottenere in ovo l'accesso agli embrioni di pulcino in fase avanzata (ad esempio, >E6). Chiudendo l'uovo e sezionando le membrane extraembrionali lontano dalla regione cranica, l'occhio embrionale è accessibile agli stadi fino a E7. Come abbiamo riportato in precedenza, la rimozione e lo spostamento delle membrane amniocorionica e corioallantoica, rispettivamente, non influenzano lo sviluppo embrionale11. Gli embrioni esposti sono vitali e sono facilmente suscettibili di manipolazione fisica. In questa fase, la cornea ha tre strati distinti (epitelio, stroma ed endotelio), che la rendono adatta per studi di guarigione delle ferite a seguito di incisione lineare nello stroma anteriore. Va notato che, a causa dell'aumento della crescita dell'allantois nel tempo, l'accesso all'occhio alla fine è occluso a E8. Per aggirare questo problema, se l'accesso agli occhi in fase successiva per la ferita è desiderabile, abbiamo scoperto che l'accesso all'occhio può essere mantenuto attraverso E9 eseguendo la manipolazione quotidiana delle membrane extraembrionali (ad esempio, a E7, E8, ecc.), In cui l'allantoide viene accuratamente riposizionata lontano dalla regione cranica per garantire che la sua crescita avvenga direzionalmente lontano dall'embrione. Ciò consente alle cornee di essere ferite in queste fasi successive (ad esempio, dopo l'innervazione).
Nel complesso, la vitalità dell'embrione e la sopravvivenza in questa tecnica si basano su diversi fattori, come garantire che venga mantenuto un ambiente di uova sterile e idratato, prestando ulteriore attenzione a non infliggere danni ai vasi sanguigni embrionali o all'allantois. L'intera superficie dell'uovo deve essere sterilizzata con etanolo prima della finestra per mantenere la sterilità. Questo perché piccoli frammenti di guscio d'uovo, che sono spesso carichi di microbi, in genere cadono nell'uovo durante la procedura di windowing. Allo stesso modo, tutti gli strumenti coinvolti nella finestratura, nelle dissezioni a membrana e nella realizzazione dell'incisione corneale devono essere accuratamente risciacquati in etanolo e asciugati o sterilizzati a fiamma prima del loro utilizzo. Inoltre, gli antibiotici dovrebbero essere aggiunti all'uovo ogni volta che l'embrione è esposto all'ambiente esterno. È inoltre fondamentale che l'embrione mantenga una corretta idratazione dopo la finestra. È necessario prestare molta attenzione per garantire che la finestra sia completamente sigillata con nastro adesivo e che non rimangano vuoti d'aria. Data l'importanza che il nastro rimanga completamente aderente alla superficie del guscio d'uovo e sigilla completamente il foro, la superficie del guscio d'uovo che circonda il foro deve essere pulita e asciugata prima di applicare il nastro. Infine, è imperativo che nessun vaso sanguigno venga inavvertitamente tagliato e che l'allantoide, che immagazzina i rifiuti liquidi dall'embrione, non venga danneggiata durante la dissezione delle membrane extraembrionali in quanto entrambi sono letali per l'embrione. Va notato che la vitalità dell'embrione è maggiore quando vengono fatte lacrime più piccole al corion e all'amnione, anche se la lacrima deve essere sufficientemente grande da posizionare le membrane extraembrionali lontano dalla regione cranica. Se queste attente misure vengono prese durante la dissezione e la rimozione delle membrane da uova di alta qualità, ci si può aspettare che quasi tutti gli embrioni sopravvivano alla procedura di windowing (~ 99%), mentre ~ 40% degli embrioni esposti sopravvive a E9 e ~ 30% a E1211. Nella nostra esperienza, ferire le cornee degli embrioni sezionati con membrana E7-E9 ha un impatto minimo sulla vitalità embrionale e gli embrioni ampi rimangono vitali attraverso E18, a quel punto la ferita corneale è completamente guarita.
Ottenere ferite che attraversano l'epitelio corneale e penetrano nello stroma anteriore è essenziale per produrre risultati affidabili e riproducibili. È necessario un coltello da microsezione di alta qualità in modo da dover applicare pochissima pressione. L'uso di un paio di pinze dell'iride curve può essere utile per cullare delicatamente la testa mentre la lacerazione viene effettuata con l'altra mano. In questo modo, le pinze dell'iride curve fungono da backstop in modo che la cornea rimanga ferma durante la ferita. La penetrazione della ferita nello stroma è variabile, soprattutto durante l'apprendimento, ma diventa più riproducibile man mano che il ricercatore impara la sensazione e l'aspetto della rottura dell'epitelio corneale. Come si sta imparando, può essere utile visualizzare le cornee ferite in sezione trasversale in modo da poter valutare la profondità di penetrazione della ferita nello stroma corneale (vedere la Figura 3B per un esempio di una cornea a sezione trasversale che mostra la profondità ideale della ferita immediatamente dopo la lacerazione corneale).
Se combinato con le tecniche classiche di biologia dello sviluppo, come l'innesto di tessuto e l'impianto di perline, o approcci moderni per la manipolazione genica, come l'elettroporazione del DNA e l'infezione retrovirale, questo modello animale di rigenerazione corneale promette di rivelare i fattori molecolari e i meccanismi cellulari necessari per ottenere il completo recupero del tessuto corneale dopo il danno. Inoltre, questo modello animale potrebbe essere utilizzato per testare la potenziale utilità di composti terapeutici esogeni per aumentare la rigenerazione corneale.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti per quanto riguarda le informazioni presentate in questo manoscritto.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione per lo sviluppo artistico e accademico attraverso l'Illinois Wesleyan University a TS e finanziato in parte da NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A.
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
