Une approche non séquentielle pour la détection rapide de l’édition de l’ARN
Summary
La détection rapide et la quantification fiable des événements d’édition de l’ARN à l’échelle génomique restent difficiles et reposent actuellement sur des méthodes de séquençage direct de l’ARN. Le protocole décrit ici utilise l’électrophorèse sur gel à gradient de microtempérature (μTGGE) comme méthode simple, rapide et portable de détection de l’édition de l’ARN.
Abstract
L’édition de l’ARN est un processus qui conduit à des altérations de séquence posttranscriptionnelles dans les ARN. La détection et la quantification de l’édition de l’ARN reposent principalement sur les techniques de séquençage et de séquençage de l’ARN de Sanger. Cependant, ces méthodes peuvent être coûteuses et prendre beaucoup de temps. Dans ce protocole, un système portable d’électrophorèse sur gel à gradient de microtempérature (μTGGE) est utilisé comme approche non séquentielle pour la détection rapide de l’édition de l’ARN. Le processus est basé sur le principe de l’électrophorèse, qui utilise des températures élevées pour dénaturer les échantillons d’acides nucléiques lorsqu’ils se déplacent sur un gel de polyacrylamide. Sur une plage de températures, un fragment d’ADN forme un gradient d’ADN entièrement double brin vers des brins partiellement séparés, puis vers un ADN simple brin entièrement séparé. Les sites d’ARN avec des bases nucléotidiques distinctes produisent différents profils de fusion dans les analyses μTGGE. Nous avons utilisé l’approche basée sur μTGGE pour caractériser les différences entre les profils de fusion de quatre fragments d’ARN modifiés et leurs fragments non édités (de type sauvage) correspondants. Les scores de similitude des modèles (PaSS) ont été calculés en comparant les modèles de bande produits par les ARN édités et non édités et ont été utilisés pour évaluer la reproductibilité de la méthode. Dans l’ensemble, la plate-forme décrite ici permet de détecter même des mutations de base unique dans les ARN de manière directe, simple et rentable. On s’attend à ce que cet outil d’analyse aide à de nouvelles découvertes en biologie moléculaire.
Introduction
Les variantes mononucléotidiques (SNV) dans l’ARN génomique, y compris les variantes A-to-I, C-to-U et U-to-C, peuvent indiquer des événements d’édition de l’ARN. Cependant, la détection des SNV dans l’ARN reste une tâche techniquement difficile. Classiquement, le rapport entre l’ARN modifié et l’ARN non modifié est déterminé par séquençage direct, réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel spécifique à l’allèle ou par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) dénaturante 1,2,3,4,5,6. Cependant, ces approches ne sont pas particulièrement rapides ou rentables, et leur faible précision, causée par des niveaux élevés de bruit, pose des goulots d’étranglement technologiques pour la détection du SNV à base d’ARN 7,8. Ici, nous décrivons un protocole basé sur l’électrophorèse sur gel à gradient de température (TGGE) pour identifier les polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP) comme une méthode alternative qui élimine le besoin d’approches de séquençage direct de l’ARN pour les analyses d’édition de l’ARN.
L’électrophorèse est une méthode privilégiée pour la séparation et l’analyse des biomolécules dans les laboratoires de sciences de la vie. TGGE permet la séparation de fragments d’ADN double brin de la même taille mais ayant des séquences différentes. La technique repose sur des différences liées à la séquence dans les températures de fusion des fragments d’ADN et les changements ultérieurs dans leurs mobilités dans les gels poreux avec un gradient de température linéairede 9,10. La fusion de fragments d’ADN génère des profils de fusion spécifiques. Une fois que le domaine avec la température de fusion la plus basse atteint la température correspondante à une position particulière dans le gel, la transition d’une structure hélicoïdale à une structure partiellement fondue se produit et la migration de la molécule s’arrêtera pratiquement. Par conséquent, TGGE utilise à la fois la mobilité (informations sur la taille) et les transitions structurelles induites par la température des fragments d’ADN (informations dépendantes de la séquence), ce qui en fait une approche puissante pour la caractérisation des fragments d’ADN. Les points caractéristiques d’un motif de fusion TGGE, qui correspondent à trois transitions structurelles de la molécule d’ADN, sont le point de dissociation initiale du brin, le point de dissociation intermédiaire du brin et le point de dissociation finale du brin (Figure 1). Les variations de séquence au sein des domaines, même les différences de base unique, affectent la température de fusion, par conséquent, les molécules avec des séquences différentes montreront des modèles de fusion discrets (dénaturation) dans les analyses TGGE. Par conséquent, TGGE peut être utilisé pour analyser les SNV dans l’ARN génomique et peut être une méthode inestimable à haut débit pour détecter l’édition de l’ARN. Ce gain à haut débit est perdu lorsque le TGGE traditionnel à base d’électrophorèse sur gel est utilisé. Cependant, une version miniaturisée de TGGE, nommée microTGGE (μTGGE), peut être utilisée pour raccourcir le temps électrophorétique du gel et accélérer l’analyse avec une augmentation de 100 fois de la productivité11. La simplicité et la compacité de la méthode μTGGE ont été améliorées par l’introduction de PalmPAGE12, un système d’électrophorèse sur gel applicable sur le terrain, portable et abordable.
Ici, un nouveau protocole basé sur TGGE est utilisé pour examiner trois types de sites d’édition d’ARN (A-to-I, C-to-U et U-to-C) dans quatre gènes, dont deux provenant de tissus d’Arabidopsis thaliana et deux exprimés dans des cellules HEK293 de mammifères (Figure 1A). Le protocole intègre l’utilisation de PalmPAGE (matériel), un système portable pour la détection rapide de l’édition d’ARN, et uMelt (logiciel)13. Avec une durée d’exécution moyenne de 15 à 30 minutes, ce protocole permet une identification rapide, fiable et facile de l’édition de l’ARN sans avoir besoin d’approches de séquençage direct de l’ARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’édition de l’ARN joue un rôle important en biologie; cependant, les méthodes actuelles de détection de l’édition de l’ARN, telles que la chromatographie et le séquençage, présentent plusieurs défis en raison de leur coût élevé, de leurs exigences de temps excessives et de leur complexité. Le protocole décrit ici est une méthode simple, rapide et rentable de détection de l’édition de l’ARN qui utilise un système portable, microdimensionnel et basé sur TGGE. Ce système peut être utilisé …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science (17H02204 et 18K19288). Ruchika a été soutenu financièrement par le gouvernement japonais (bourse MEXT). Nous remercions Mme Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) et le Dr Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) pour leur aide dans les expériences liées à l’électrophorèse.
Materials
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
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