Summary
De gepresenteerde methode biedt een innovatieve manier voor het engineeren van biomimetische vezelstructuren in driedimensionale (3D) steigers (bijv. Hartklepblaadjes). 3D-geprinte, geleidende geometrieën werden gebruikt om vorm en afmetingen te bepalen. Vezeloriëntatie en -kenmerken waren individueel instelbaar voor elke laag. Meerdere monsters kunnen in één opstelling worden vervaardigd.
Abstract
Elektrospinning is een veelgebruikte techniek geworden in cardiovasculaire weefseltechnologie omdat het de mogelijkheid biedt om (micro-)vezelige steigers met instelbare eigenschappen te maken. Het doel van deze studie was om meerlagige steigers te maken die de architecturale vezelkenmerken van menselijke hartklepblaadjes nabootsen met behulp van geleidende 3D-geprinte collectoren.
Modellen van aortaklepkussens werden gemaakt met behulp van commerciële computerondersteunde ontwerpsoftware (CAD). Geleidend polymelkzuur werd gebruikt om 3D-geprinte foldersjablonen te fabriceren. Deze cusp-negatieven werden geïntegreerd in een speciaal ontworpen, roterende elektrospinning doorn. Drie lagen polyurethaan werden op de collector gesponnen, waarbij de vezeloriëntatie van menselijke hartkleppen werd nagebootst. Oppervlakte- en vezelstructuur werd beoordeeld met een scanning elektronenmicroscoop (SEM). De toepassing van fluorescerende kleurstof maakte bovendien de microscopische visualisatie van de meerlagige vezelstructuur mogelijk. Trekproeven werden uitgevoerd om de biomechanische eigenschappen van de steigers te beoordelen.
3D-printen van essentiële onderdelen voor de elektrospinning rig was in korte tijd mogelijk voor een laag budget. De aortaklepcusps die volgens dit protocol werden gemaakt, waren drielaags, met een vezeldiameter van 4,1 ± 1,6 μm. SEM-beeldvorming onthulde een gelijkmatige verdeling van vezels. Fluorescentiemicroscopie onthulde individuele lagen met verschillend uitgelijnde vezels, waarbij elke laag precies de gewenste vezelconfiguratie bereikte. De geproduceerde steigers vertoonden een hoge treksterkte, vooral langs de uitlijningsrichting. De afdrukbestanden voor de verschillende verzamelprogramma's zijn beschikbaar als Aanvullend bestand 1, Aanvullend bestand 2, Aanvullend bestand 3, Aanvullend bestand 4 en Aanvullend bestand 5.
Met een zeer gespecialiseerde setup en workflow protocol is het mogelijk om weefsels met complexe vezelstructuren over meerdere lagen na te bootsen. Direct spinnen op 3D-geprinte collectoren creëert een aanzienlijke flexibiliteit bij het produceren van 3D-vormen tegen lage productiekosten.
Introduction
Hart- en vaatziekten zijn de belangrijkste doodsoorzaak in westerse landen 1. Hoewel er uitgebreid onderzoek wordt gedaan op dit gebied, wordt geschat dat de last van degeneratieve hartklepaandoeningen de komende jaren nog verder zal toenemen2. Chirurgische of interventionele hartklepvervanging is mogelijk als een therapeutische optie. Op dit punt zijn mechanische en bioprosthetische hartkleppen beschikbaar, beide met individuele nadelen. Mechanische kleppen zijn trombogeen en vereisen levenslange antistolling. Hoewel biologische kleppen geen antistolling vereisen, vertonen ze een gebrek aan remodellering, een hoge snelheid van verkalking en gelijktijdige afbraak3.
Weefselmanipulatie hartkleppen kunnen deze nadelen mogelijk aanpakken door een microfibroussteiger in het lichaam te introduceren die in vivo remodellering mogelijk maakt. Verschillende methoden, bijvoorbeeld elektrospinning (ESP), decellularisatie, micromolding, spray, dip-coat en 3D-bioprinting, zijn beschikbaar. Deze methoden kunnen worden gekozen voor het creëren van specifieke eigenschappen, goedkoper en sneller zijn, of gewoon vanwege een gebrek aan alternatieven. Methoden en materialen kunnen zelfs worden gecombineerd om complexere structuren te creëren4. ESP is bijvoorbeeld een standaardtechniek voor het maken van steigers in tissue engineering, waardoor de combinatie van verschillende materialen en de aanpassing van vezeldiameters, vezeloriëntaties en porositeiten4 mogelijk is. Bovendien zorgen verschillende nabewerkingstechnieken voor geoptimaliseerde weefselremodellering, verbeterde hemocompatibiliteit en instelbare biologische afbraak van elektrospunsteigers 5,6,7.
Basic ESP maakt gebruik van statische of roterende collectoren, die een directe invloed hebben op de mate van vezeluitlijning en de verkregen vezeldiameters8. Vanwege productiebeperkingen bestaan klassieke ESP roterende collectoren uit roterende vaten, schijven, draden of metalen staven. De introductie van 3D-printen maakt het mogelijk om meer geïndividualiseerde collectorgeometrieën te creëren die niet worden beperkt door traditionele productietechnieken. Deze individualisering is vooral nuttig voor het maken van 3D-constructies zoals hartklepblaadjes.
De natuurlijke drielaagse (fibrosa, spongiosa, ventricularis) architectuur van menselijke hartklepblaadjes is de reactie van de weefsels op de mechanische krachten en schuifspanning waaraan ze worden blootgesteld tijdens de hartcyclus 9,10. De vezels van de lamina fibrosa zijn omcirkeld georiënteerd, terwijl de vezels van de lamina spongiosa willekeurig zijn uitgelijnd en die van de lamina ventriculaire radiaal. Een drievoudige laag met de bijbehorende vezeloriëntaties wordt dus voorgesteld om de eigenschappen van deze kleppen na te bootsen in een weefselmanipulatiesteiger.
Het workflowprotocol beschrijft een innovatieve methode om drielaagse, 3D-hartklepfolders te produceren met behulp van 3D-printen en elektrospinning. Bovendien wordt een kwaliteitscontrolestap gepresenteerd om een nauwkeurige vezeloriëntatie in elke laag te garanderen.
Protocol
1. Voorbereidende werkzaamheden
- 3D printen
OPMERKING: Voor de volgende stappen moeten de STL-bestanden (Standard Triangle Language) worden gedownload die bij dit manuscript zijn geleverd als Supplemental File 1, Supplemental File 2, Supplemental File 3, Additionalal File 4 en Supplemental File 5 . Collectoronderdelen worden geleverd als STL-bestanden. De verbindingsflens wordt geleverd als "STandard for the Exchange of Product model data" (STEP) bestand om aanpassing van de collector aan individuele opstellingen mogelijk te maken. Verder wordt een technische tekening voor de centrale metalen staven verstrekt voor conventionele productie als Supplemental File 6.- Open de snijsoftware (zie de tabel met materialen) en configureer de actieve printkop voor niet-geleidend polymelkzuur (PLA) en een mondstuk van 0,4 mm.
OPMERKING: Snijsoftware, filament en nozzlediameter kunnen variëren afhankelijk van de beschikbare 3D-printer. - Upload de STL-bestanden Specimen_mount_A (Supplemental File 3) en Speciment_mount_B (Supplemental File 4) naar de snijsoftware.
- Draai de modellen, zodat de driehoekige oppervlakken op de bouwplaat worden geplaatst.
- Markeer alle onderdelen, klik met de rechtermuisknop en selecteer Geselecteerde modellen vermenigvuldigen. Voer 1 in de prompt Aantal kopieën in en klik op OK. Plaats in totaal vier modellen op de bouwplaat.
- Stel de dikte van de plak in op 0,1 mm, de wanddikte op 1 mm, de invuldichtheid op 40% en schakel het selectievakje Ondersteuning genereren uit .
- Klik op de knop Segmenteren | Opslaan in Verwisselbaar om het afdrukbestand op een USB-station op te slaan.
- Laad niet-geleidende PLA in de printer en start het afdrukbestand.
- Nadat de afdruk is voltooid, verwijdert u de modellen van de bouwplaat en controleert u of ze in de onderste hoeken kromtrekken.
- Behoud in de snijsoftware de materiaalparameters en vervang de modellen door Collector_Flange (aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 5) en Leaflet_Template (aanvullend bestand 2).
- Draai de flens, zodat het vlakke cirkelvormige oppervlak tegen de bouwplaat ligt. Draai bovendien de foldersjabloon, zodat het vierkante oppervlak direct op de bouwplaat wordt geplaatst.
- Markeer de flens en vermenigvuldig het model zoals in stap 1.1.4. Type 1 om 1 exemplaar en 1 origineel van het flensmodel op de bouwplaat te ontvangen.
- Markeer het bijsluitermodel en vermenigvuldig met 8 om in totaal negen bijsluitermodellen te ontvangen, volgens de stappen beschreven in 1.1.4.
- Stel de plakdikte in op 0,1 mm, de wanddikte op 1 mm, de invuldichtheid op 80% en schakel het selectievakje Ondersteuning genereren uit .
- Klik op de knop Segmenteren | Opslaan in Verwijderbaar om het nieuwe afdrukbestand op een USB-station op te slaan.
- Laad geleidend PLA in de printer en start het afdrukproces.
- Verwijder na voltooiing van de afdruk de modellen van de bouwplaat. Verwijder individuele filamentvezels aan de onderkant van het foldernegatief voorzichtig met een draadsnijder als deze aanwezig zijn in de bijsluitermodellen (omdat er geen ondersteuningsstructuren zijn gebruikt).
- Open de snijsoftware (zie de tabel met materialen) en configureer de actieve printkop voor niet-geleidend polymelkzuur (PLA) en een mondstuk van 0,4 mm.
- Spinoplossing
LET OP: Tetrahydrofuraan (THF) en dimethylformamide (DMF) zijn schadelijke oplosmiddelen die niet mogen worden ingeademd of in contact mogen komen met de huid. Het wordt sterk aanbevolen om oplosmiddelbestendige handschoenen en een beschermende bril te dragen tijdens het hanteren ervan. Wanneer u ze hanteert, werk dan onder een afzuigkap, omdat ze extreem vluchtig zijn.- Plaats een weegschaal onder de afzuigkap en plaats er een glazen fles met schroefdop van 200 ml op. Tarra de schaal.
- Giet 50 ml DMF en 50 ml THF in de glazen fles. Let op het gewicht van de oplosmiddelen.
- Plaats een magnetische staaf in de fles, plaats de fles op een magneetroerder en schakel deze in.
- Vermenigvuldig het genoteerde gewicht met 0,15 (= 15% w/v) en breng de overeenkomstige hoeveelheid polyurethaan (PU) langzaam over in de glazen fles met het oplosmiddelmengsel (DIN 1310).
- Sluit de fles en roer gedurende ten minste 12 uur bij kamertemperatuur om een homogene oplossing te verkrijgen.
2. Electrospinning instellen
- Vergadering
OPMERKING: Aangezien de foldersteigers die met de gepresenteerde collector zijn gemaakt relatief klein zijn, wordt het optionele gebruik van een trommeldoorn met grote diameter (D: 110 mm) aanbevolen. Dit maakt het mogelijk om grotere, meerlaagse steigers te maken, wat gunstig zal zijn voor microscopische, biocompatibiliteit en biomechanische beoordeling.- Monteer de collector met behulp van de 3D-geprinte onderdelen en zes M3 x 15 schroeven.
- Gebruik drie schroeven om de metalen staven aan een van de flenzen te bevestigen.
- Schuif een Specimen_mount_B tussen de metalen staven. Zorg ervoor dat de spaties voor sjablonen in de tegenovergestelde richting van de flens wijzen.
- Vul de drie sleuven van de Specimen_mount_B met sjablonen voor hartklepblaadjes.
- Plaats Specimen_mount_A bovenop en vul de ruimtes met sjablonen.
- Schuif een andere Specimen_mount_A in en vul de ruimtes met sjablonen.
- Fixeer de sjablonen door de tweede Specimen_mount_B erop te plaatsen.
- Leg de tweede flens erop en gebruik de M3-schroeven om deze vast te zetten.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de bijsluitersjablonen allemaal in dezelfde richting zijn georiënteerd (rechte rand van de bijsluiter evenwijdig aan de metalen staven). - Plaats de geassembleerde foldercollector in de elektrospinningopstelling en bevestig de flenzen stevig aan de motoras (d.w.z. M6-schroeven en vleugelmoeren) (figuur 1).
LET OP: Aangezien geleidend PLA brozer is dan gewone PLA, gebruikt u een momentsleutel van 1,4 Nm bij het bevestigen van bouten die druk uitoefenen op het materiaal om knakken te voorkomen. - Plaats een naaldhouder op 30 cm van de collector.
- Bevestig een 14 gauge (G) naald met een platte punt in de naaldhouder en fixeer deze ter hoogte van de as van de collector.
- Sluit een flexibele, oplosmiddelbestendige buis (bijv. polytetrafluorethyleen (PTFE)) aan op de Luer-lock-poort van de naald.
OPMERKING: DMF en THF lossen veel kunststoffen op. Het is noodzakelijk om oplosmiddelbestendige materialen te gebruiken bij het werken met deze oplosmiddelen, bijvoorbeeld metalen en glazen gereedschappen. Wanneer plastic gereedschap nodig is (d.w.z. spuit of slang), zorg er dan voor dat u oplosmiddelbestendige materialen gebruikt. - Leid de buis naar de spuitpomp voor latere aansluiting van de met polymeer gevulde spuit.
- Aansluiting van de voedingseenheid (PSU)
LET OP: Zorg er tijdens de installatie voor dat de voeding is losgekoppeld van de hoofdvoedingsbron.- Sluit twee afgeschermde hoogspanningskabels aan op de anode en kathode van de voeding.
- Sluit met behulp van een krokodillenclip de kabel aan die is aangesloten op de kathode (- paal) op de 14 G-naald. Controleer de verbinding tussen clip en naald. Leid vervolgens de hoogspanningskabel, zodat deze buiten het draaiende gebied loopt om interferentie te voorkomen.
- Sluit de collector aan op de anode (+ paal) met behulp van een krokodillenclip en de tweede hoogspanningskabel. Gebruik een sleepring of een schuifcontact met behulp van een gestripte kabel om contact te maken bij de flens van de collector.
- Bereiding van de spuit
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd onmiddellijk voordat het spinproces begint.- Vul een Luer-lock spuit van 20 ml met de spinoplossing die in stap 1.2 is bereid.
- Sluit de spuit aan op de oplosmiddelbestendige buis en duw de oplossing handmatig in het slangsysteem totdat er een druppel zichtbaar is aan de punt van de naald.
- Plaats de spuit in de spuitpomp. Voer na het inschakelen van de pomp de volgende parameters in: diameter: 19,129 mm; volume: 5 ml; snelheid 3 ml/h.
3. Elektrospinning proces
- Motor test run
OPMERKING: Het vervaardigen van de collector met behulp van 3D-printen kan leiden tot een beweging buiten het midden van de collector. Daarom wordt een testrun met lagere toerentallen maar zonder hoge spanning ten zeerste aanbevolen.- Open de motorbesturingssoftware door te dubbelklikken op het pictogram op de computer.
- Maak verbinding met de motorbediening door op de knop Verbinden te klikken.
- Nadat u verbinding hebt gemaakt, selecteert u de modus Profielsnelheidsbediening en klikt u op het tabblad Bediening in de linkerbovenhoek van het scherm.
- Selecteer het tabblad Profielsnelheid onder de knop Snelle stop omlijst door een rode lijn. Typ de volgende instellingen in: Doelsnelheid: 200 rpm; profiel versnelling: 100; profielvertraging: 200; snelle stop: 5000.
OPMERKING: De draairichting moet aan de naaldzijde omhoog zijn, die kan worden aangepast door het teken in het veld "doelsnelheid" te veranderen van "+" in "-". - Start de testrun en controleer de collector op onbalans. Als de collector soepel werkt, gaat u verder met het protocol. Anders stopt u de motor en past u de collector opnieuw aan zoals beschreven in stap 2.1.9.
- Stop de motor door op de knop Inschakelen te klikken en wijzig de doelsnelheid in 2.000 tpm.
- Productieproces
OPMERKING: Electrospinning is een proces met een hoge afhankelijkheid van omgevingsparameters. Optimale elektrospinningresultaten werden verkregen tussen 15-20% relatieve vochtigheid bij een temperatuur tussen 21 en 24 °C.- Eerste laag
OPMERKING: Tijdens de installatiefase kan zich een gedroogde druppel PU hebben gevormd aan de punt van de naald. Verwijder de druppel indien nodig met een lang, niet-geleidend gereedschap.- Klik in de motorbesturingssoftware op de knop Bediening inschakelen om de motor in te schakelen.
- Schakel de hoogspanningsvoeding in en pas de spanning aan voor zowel anode als kathode: minuspool (naald): 18 kV; plus paal (collector): 1,5 kV.
- Start de spuitpomp met een debiet van 3 ml/h.
- Stel een timer in op 20 min.
- Observeer de naaldpunt voor de vorming van een kleermakerskegel. Afhankelijk van de vorm van de kegel aan de punt van de naald, past u de spanning aan de kathode aan in stappen van ±100 V totdat een stabiele kleermakerskegel is vastgesteld.
OPMERKING: Als de druppel hangt, is de spanning te laag. Een onstabiele stroming kan er echter op wijzen dat de spanning te hoog is ingesteld. - Wacht 20 minuten totdat de cusp-sjablonen voldoende zijn bedekt met vezels.
- Schakel de spuitpomp uit.
- Schakel de voeding uit door de aan/uit-schakelaar om te draaien.
- Stop de motor door op de knop Schakel ingeschakeld in de motorbesturingssoftware te klikken.
LET OP: Om te voorkomen dat bewegende delen in het systeem worden beschadigd, wacht u totdat de collector volledig is gestopt om de testkamer te openen.
- Tweede laag
- Wijzig in de motorbesturingssoftware de doelsnelheid van het invoerveld naar 10 rpm.
- Herhaal stap 3.2.1.1-3.2.1.9.
- Derde laag
OPMERKING: Voordat de steigers volledig droog zijn, zijn ze extreem gevoelig voor mechanische belasting. Wees zeer voorzichtig bij het uitvoeren van stappen 3.2.3.2-3.2.3.6. Vermijd het aanraken van de steigers / vezels tijdens deze stappen, omdat de steiger onbruikbaar kan worden gemaakt.- Open voorzichtig de schroeven die de collectorflenzen met de motoras verbinden en verwijder de foldercollector (figuur 2B) uit de elektrospinning-inrichting.
- Snijd met behulp van een scalpel de elektrospunvezels langs de buitencontour van elke bijsluitersjabloon (figuur 2C).
- Verwijder de flens aan één kant van de collector.
- Trek de 3D-geprinte inzetstukken eruit en scheid de foldersjablonen van de niet-geleidende driehoekige houders.
- Draai alle foldersjablonen 90° en monteer de collector opnieuw.
- Plaats de collector in de elektrospinningopstelling en zet deze stevig vast.
- Nogmaals, controleer op onbalans voordat u doorgaat met het spinproces.
- Wijzig in de motorbesturingssoftware de doelsnelheid van het invoerveld naar 2.000 tpm.
- Herhaal stap 3.2.1.1-3.2.1.9.
OPMERKING: Na het voltooien van het elektrospinningproces, wordt het ten zeerste aanbevolen om de slang en naald te spoelen met pure DMF om verstopping van de slang te voorkomen.
- Fluorescerende geverfde steigers (optioneel)
OPMERKING: Fluorescerende kleurstoffen worden gebruikt om de vezels zichtbaar te maken onder een conventionele fluorescentiemicroscoop. Dit is alleen nodig bij het implementeren van de methode en voor kwaliteitscontrole nadat nieuwe instellingen zijn toegepast. Het gebruik van fluorescerende kleurstoffen wordt niet aanbevolen bij het vervaardigen van steigers met behulp van gevestigde instellingen.- Verdeel de in stap 1.2 bereide spinoplossing in drie gelijke porties in afzonderlijke flessen.
- Meet met behulp van een schaal 1 mg fluorescerende kleurstof voor elke gram (0,1 wt%) polymeeroplossing. Herhaal dit voor alle drie de fluorescerende kleurstoffen (d.w.z. Fluoresceïne, Texas Red, 4',6-diamidino-2-fenylindool [DAPI]).
- Voeg de kleurstof toe aan de spinoplossing, sluit het deksel van de fles en roer gedurende 2-3 uur of tot homogenisatie.
OPMERKING: Om te voorkomen dat de fluorescerende kleurstoffen vervagen, moet u de draaiende oplossing zoveel mogelijk beschermen tegen licht, d.w.z. door een ondoorzichtig deksel over de magneetroerder te plaatsen. Het proces voor fluorescerende geverfde steigers lijkt sterk op het standaardproces dat wordt beschreven in stappen 3.2.1-3.2.3. - Vervang in stap 3.2.1 de standaardspuit door een spuit gevuld met de draaiende oplossing die de eerste fluorescerende kleurstof bevat.
- Vervang in stap 3.2.2 de momenteel gebruikte slang en naald door nieuwe of gereinigde. Plaats vervolgens een spuit met de draaiende oplossing met de tweede fluorescerende kleurstof in de spuitpomp.
- Vervang in stap 3.2.3 opnieuw de slang en de naald door nieuwe of gereinigde en vervang de spuit door een spuit die is gevuld met een draaiende oplossing die de derde fluorescerende kleurstof bevat.
OPMERKING: Om vertraging tijdens het productieproces te voorkomen, is het nuttig om drie sets slangen en naalden te gebruiken. Als alternatief kunnen de buis en naald grondig worden gespoeld met THF en DMF tussen de productie van lagen totdat er geen spinoplossing met fluorescerende kleurstof in het systeem achterblijft.
- Eerste laag
4. Nabewerking en monsterverwerving
- Nabewerking steigers
- Verwijder de collector uit het elektrospinningapparaat.
- Knip met behulp van een scalpel elke sjabloon vrij aan de basis zoals beschreven in stap 3.2.3.2.
- Open het verzamelprogramma, zoals hierboven beschreven, en plaats de sjablonen, onder de basis, op een lade.
- Plaats de lade een nacht in een droogkast bij 40 °C.
- Nadat de monsters volledig zijn gedroogd, gebruikt u een scalpel om voorzichtig langs de randen van de bijsluitersjabloon te snijden om overtollige vezels te verwijderen.
- Schil daarna voorzichtig de foldersteiger van de sjabloon en plaats deze op een dienblad voor verdere verwerking.
Representative Results
Dit protocol is gericht op de ontwikkeling van een drielaagse foldersteiger bestemd voor gebruik in cardiovasculaire weefseltechnologie van hartkleppen. Het bootst de collageenconfiguratie van de drie lagen in de inheemse menselijke hartklep na. Elke laag bestaat uit vezels met een totale diameter van 4,1 ± 1,6 μm (figuur 1).
Figuur 1: Vezeleigenschappen. Analyse van vezels: Totaal aantal vezels; Diameter in μm: gemiddelde, modus, standaarddeviatie, minimale diameter, maximale diameter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De foldersjablonen zijn ontworpen voor een Ø 24 mm aortaklepprothese (figuur 2C). Na het drogen behielden de deelsteigers hun vorm van een 3D-hartklepcusp (figuur 3A).
Figuur 2: Electrospinning setup. (A) Geassembleerde 3D-geprinte collector in de roterende opstelling; B) CAD-weergave van de 3D-printbare collector; C) CAD-weergave van het negatief weergegeven hartklepblad negatief; driehoek geeft gedeeltelijk ingezoomd aan. Afkorting: CAD = computer-aided design. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
SEM-beeldvorming werd gebruikt om de uitgelijnde en niet-uitgelijnde lagen te beoordelen (TEMP F3512-21). Foto's werden genomen met een vergroting van 100x, 500x en 2.000x op drie verschillende locaties op een steiger. Uitgelijnde vezelsteigers verschijnen met een glad oppervlak en strikte oriëntatie in de omtrekrichting (figuur 3B). Visuele analyse van het 2.000x beeld ten opzichte van de vezeloriëntatie bevestigt de primaire uitlijning van de vezels (figuur 3C). Niet-uitgelijnde vezelsteigers vertonen een vergelijkbaar glad oppervlak in vergelijking met de uitgelijnde vezels. Vezeloriëntatie is verstoord, met veel prominente kruispunten tussen vezels (figuur 3D). Daaropvolgende visuele analyse bevestigt de onuitlijning van vezels zonder dat primaire oriëntatie zichtbaar is (figuur 3E).
Figuur 3: Electrospun leaflet en SEM imaging. (A) Electrospun meerlagige folder en 3D-geprinte folder collector; (B) SEM-afbeelding van niet-uitgelijnde vezels (vergroting 1.000x); (C) Vezeloriëntatieanalyse van niet-uitgelijnde vezels; (D) SEM-afbeelding van uitgelijnde vezels (vergroting 1.000x); (E) Vezeloriëntatieanalyse van uitgelijnde vezels. Schaalstaven = 10 mm (A), 100 μm (B, D). Afkorting: SEM = scanning elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Beeldvorming van fluorescerende geverfde meerlaagse steigers onthulde drie individuele lagen met verschillende vezeloriëntaties (figuur 4D). De onderste laag (figuur 4A; blauw) toont uitgelijnde vezels in horizontale oriëntatie met zeer weinig snijpunt tussen de vezels. De middelste laag (figuur 4B; groen) toont niet-uitgelijnde vezels zonder primaire vezeloriëntatie. De bovenste laag (figuur 4C; rood) toont uitgelijnde vezels in een loodrechte oriëntatie. Visuele analyse van de bovenste en onderste lagen onthult een gemiddelde hoek tussen de twee lagen van 89°, wat in overeenstemming is met de 90° rotatie van de collector tijdens het spinproces (figuur 4E).
Figuur 4: Fluorescentiemicroscopie van meerlaagse steiger. (A) Fluorescentiebeeld van de eerste laag met primaire oriëntatie van linksonder naar rechtsboven; (B) Fluorescentiebeeld van de tweede laag met niet-uitgelijnde vezeloriëntatie; (C) Fluorescentiebeeld van de derde laag met primaire oriëntatie van rechtsonder naar linksboven; (D) Fluorescentiebeeld van alle drie de lagen gecombineerd in één steiger; (E) Vezeloriëntatieanalyse voor alle drie de lagen (Laag 1: blauw; Laag 2: groen; Laag 3: rood); vergroting = 400x (A-D); schaalstaven = 100 μm (A-D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Diktemeting werd uitgevoerd op 21 monsters (figuur 5A) (TEMP F3510-21). Alle monsters zijn gemaakt met dezelfde parameters. Temperatuur en vochtigheid kunnen verschillen tussen 20,3 °C en 26,1 °C en respectievelijk 35% en 55% luchtvochtigheid. De resultaten toonden een relatief lineaire toename in dikte van ~2,65 μm per minuut.
Een ander experiment toonde de consistentie van de resultaten na 60 minuten draaien onder overeenkomende parameters (figuur 5B). Vochtigheid en temperatuur kunnen verschillen tussen 35% en 50% vochtigheid en respectievelijk 20,3 °C tot 26,1 °C. De resultaten waren steigers tussen 126 en 181 μm dikte. De gemiddelde dikte was 151,11 ± 13,17 μm. De toename in dikte was gemiddeld ~2,52 μm per minuut.
Figuur 5: Diktemeting. (A) Dikte van steigers per gesponnen tijd; n = 21; Correlatiecoëfficiënt (r) = 0,653; p** = 0,00132; B) dikte van de monsters na 60 min; n = 13; rode lijn: gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Trekproeven voor uitgelijnde en niet-uitgelijnde vezelsteigers werden in twee richtingen uitgevoerd, langs de omtrekrichting en loodrecht daarop. Elke specie bestond uit 15 exemplaren. Monsters werden genomen uit vliegtuigsteigers volgens DIN 53504:2017-03. De dikte werd gemeten op drie verschillende plekken op elk monster en gebruikt om de maximale krachtwaarden per vierkante mm te berekenen.
De diktewaarden liggen tussen 0,03 en 0,2 mm. De vergelijking van de uiteindelijke treksterkte toonde een significant verschil (p < 0,001) tussen oriëntaties voor de uitgelijnde vezelsteigers (figuur 6A). De steigers bereikten een maximale sterkte van 12,26 ± 2,59 N/mm2 langs de omtrekoriëntatie. De treksterkte werd teruggebracht tot 3,86 ± 1,08 N/mm2 loodrecht.
Niet-uitgelijnde vezelsteigers vertonen geen verschil in de uiteindelijke treksterkte voor de verschillende oriëntaties (F1: 7,19 ± 1,75 N/mm2, F2: 7,54 ± 1,59 N/mm2; p = 0,60). De vergelijkende analyse van de rek bij breuk voor de uitgelijnde vezelsteigers toonde significante verschillen (p < 0,001) in uitzetting tussen de richtingen (figuur 6B). De uitbreidbaarheid bereikte 187,01 ± 39,37% in de omtrekrichting vergeleken met 107,16 ± 30,04% in loodrechte richting.
Daarentegen onthulde de rek bij breuk voor de niet-uitgelijnde vezelmatten een uniforme uitrekbaarheid in beide richtingen (F1: 269,74 ± 24,78 %; F2: 285,01 ± 25,58 %; p = 0,69). Representatieve spannings-rekcurven vertonen enorme verschillen in het gedrag van het materiaal, afhankelijk van de richting waarin de trekkracht wordt uitgeoefend. Niet-uitgelijnde vezelmatten vertoonden lineair elastisch gedrag, terwijl uitgelijnde vezelmatten niet-lineariteit in de axiale richting vertoonden.
Figuur 6: Trekproeven van uitgelijnde en niet-uitgelijnde vezels. (A) Ultieme treksterkte voor uitgelijnde en niet-uitgelijnde vezelmatten in omtrek- en axiale richtingen; n = 15; (B) Rek bij breuk voor uitgelijnde en niet-uitgelijnde vezelmatten in omtrek- en axiale richtingen; n = 15; (C) Representatieve spannings-rekcurven van uitgelijnde en niet-uitgelijnde steigers, respectievelijk getrokken in axiale en omtrekrichtingen. (***p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Productie metrics | |||||||||
| Naam | Materiaal | Aantal | Totale tijd | Totaal gewicht [g] | Kosten [€ per kg] | Totale kosten | |||
| 1 | Specimen_Mount_A | Regulier PLA | 2 | 18:19 | 159 | slechts 51,33 € | slechts 8,16 € | ||
| 2 | Specimen_Mount_B | Regulier PLA | 2 | 19:42 | 161 | slechts 51,33 € | 8,26 € | ||
| 3 | Collector Flens | Geleidende PLA | 2 | 10:40 | 95 | 99,98 € | 9,50 € | ||
| 4 | Leaflet_Inlet | Geleidende PLA | 9 | 05:32 | 31 | 99,98 € | slechts 3,10 € | ||
| Totaal | slechts 29,02 € | ||||||||
Tabel 1: Productiestatistieken. Tabel met hoeveelheid, productietijd, hoeveelheid materiaal die nodig is en kosten voor 3D-geprinte onderdelen. Afkorting: PLA = polymelkzuur.
Aanvullend bestand 1: Aanpasbare collectorflens. Stap-bestand om collector flens aan te passen en af te drukken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Foldersjabloon. STL-bestand om folder sjabloon af te drukken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 3: Specimen mount A. STL-bestand om specimen mount A. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 4: Specimen mount B. STL-bestand om specimen mount B. Te printen klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 5: Collectorflens. STL-bestand om collector flens te printen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 6: Drijfmetaal staaf. Technische tekening voor de constructie van drijfstenen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Het beschreven protocol presenteert twee innovaties op het gebied van (cardiovasculaire) tissue engineering: goedkope productie van volledig 3D-geprinte fantomen voor elektrospinning en het gebruik van een veelzijdige collector om aanpasbare, meerlagige hartklepblaadjes te produceren.
Onlangs is 3D-printen een waardevol hulpmiddel geworden voor de productie van laboratoriumapparatuur, bijvoorbeeld bioreactoren of productie- en testopstellingen11,12. Daarom was het mogelijk om de in deze studie gepresenteerde elektrospinningopstelling in korte tijd en voor een betaalbaar budget te vervaardigen (tabel 1). Dit blijft in lijn met eerdere bevindingen voor de goedkope productie van elektrospinning-opstellingen met behulp van 3D-printen13.
Bovendien is dit, voor zover de auteurs weten, de eerste keer dat een geleidend 3D-printmateriaal werd gebruikt om een elektrospinningcollector voor hartklepblaadjes te maken. Tot nu toe werden 3D-geprinte collectoren vervaardigd door metaallasersintering14 of met behulp van niet-geleidende polymeerprinting en daaropvolgende nabewerking met een geleidende coating15. In tegenstelling tot deze nieuwe aanpak zijn die procedures aanzienlijk in het nadeel omdat ze duurder zijn, veel langer duren of meer handarbeid vereisen.
Elektrospinning is afhankelijk van een veelheid aan variabelen die van invloed zijn op de morfologie van de gecreëerde vezels. Hoewel er verschillende commerciële elektrospinning-opstellingen op de markt beschikbaar zijn, gebruiken veel onderzoeksgroepen sterk geïndividualiseerde opstellingen om aan hun specifieke behoeften te voldoen16. Hiermee rekening houdend, moeten de beschreven waarden in dit protocol (spanning, afstand en rotatiesnelheid) mogelijk worden aangepast voor individuele opstellingen en moeten ze worden gezien als een startpunt in plaats van vaste waarden. Verder is bekend dat omgevingsparameters een significante invloed kunnen hebben op de elektrospinningresultaten 17,18. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om ten minste de temperatuur en vochtigheid in de elektrospinning-rig te regelen. Optimale elektrospinningresultaten werden verkregen tussen 15-20% relatieve vochtigheid bij een temperatuur tussen 21 en 24 °C. Om dit protocol te volgen, is de volgende apparatuur essentieel: een motor die in staat is om een collector met een gewicht van ongeveer 300 g te versnellen tot een toerental van 2.000 tpm, een spuitpomp die geschikt is voor kleine volumedebieten van 1-3 ml / h, en een tweepolige voedingseenheid die in staat is om gelijkstroom (DC) van ±20 kV te ±.
In lijn met eerdere studies was het mogelijk om de vezelige structuur van de elektrospunsteigers te visualiseren door fluorescentiemicroscopie19. Het was mogelijk om met succes de meerlagige structuur van de steiger te demonstreren, inclusief de variërende vezeloriëntaties. Vooral bij het werken met meerdere lagen of meerdere materialen, moet de introductie van fluorescerende kleurstoffen worden beschouwd als een standaardprocedure voor strenge kwaliteitscontrole. Het kan de visuele beoordeling van resultaten verbeteren na wijzigingen in de parameters of het workflowprotocol. Het aanbrengen van kleurstof in steigers voor in vivo of in vitro beoordeling kan niet worden aanbevolen. Dit is belangrijk om interferentie met gevestigde analysemethoden te voorkomen.
Het nabootsen van natuurlijke hartklepmorfologie is van groot belang om een weefsel-gemanipuleerde replicatie te produceren die kan worden gebruikt als een hartklepprothese (figuur 4B). Het is aangetoond dat de specifieke klepgeometrie een grote invloed heeft op in vivo remodellering20. In deze context is 3D-printen van de foldergeometrie voor elektrospinning van voordeel, omdat iteraties eenvoudig en snel te implementeren zijn. Zelfs de productie van gepersonaliseerde klepgeometrieën is denkbaar en de verdere ontwikkeling van individuele en gepersonaliseerde 3D-modellen van hartklepafwijkingen, bijvoorbeeld voor onderwijsdoeleinden, is mogelijk.
Verdere verbetering van weefsel-gemanipuleerde hartklepeigenschappen staat centraal in de huidige onderzoeksinspanningen, omdat verschillende onderzoeksgroepen hebben gewerkt aan de ontwikkeling van meerlagige steigers met gedefinieerde vezeloriëntaties. Masoumi et al. vervaardigd composiet steigers uit een gegoten polyglycerol sebacate laag en elektrospun polycaprolacton (PCL) vezelmatten21. Zo zou een drievoudige laag kunnen worden gemaakt van twee georiënteerde elektrospunlagen gescheiden door een vel microgefabriceerde polyglycerol sebacate. In tegenstelling tot de aanwezige steigers waren ze echter niet in een 3D-vorm en bootsten ze de middelste laag (spongiosa) adequaat na. Een andere benadering voor het produceren van een bio-geïnspireerde weefsel-gemanipuleerde hartklep werd nagestreefd door Jana et al.22,23. Ze produceerden met succes drielaagse steigers met georiënteerde vezels met behulp van aluminium collectoren voor PCL-gebaseerde elektrospinning. Nogmaals, deze steigers vertoonden ook morfologische onvolkomenheden, omdat ze alleen een 2D-uiterlijk hebben en de uiteindelijke steiger doordrongen is van spaken.
Hoewel het protocol gedetailleerde informatie geeft over hoe 3D, drielaagse hartklepblaadjes worden geproduceerd, zijn er nog verschillende stappen nodig om een echte hartklepprothese te maken. Een stent met een diameter van 24 mm wordt aanbevolen voor de hier beschreven folders. Als aanvulling op de gebruikte stent kunnen de folders worden voorzien van extra ondersteuningsstructuren voor het naaien. Om maximale flexibiliteit mogelijk te maken, zijn de hier getoonde folders niet geïndividualiseerd naar een specifiek stentontwerp. Dit kan worden gedaan door eenvoudig de sjabloon te wijzigen met behulp van CAD-software.
Hoewel gebruikt voor hartklepweefseltechnologie, zal de gepresenteerde methode gemakkelijk toepasbaar zijn voor elektrospinningopstellingen in orthopedie24, urologie25, otolaryngologie26 en anderen. De productie van geavanceerde en/of geïndividualiseerde 3D-constructies is mogelijk door de implementatie van andere 3D-geprinte collectoren. Hoewel het materiaal van de collector is veranderd, blijft het principe van elektrospinning intact27. Daarom is het gebruik van verschillende polymeren theoretisch mogelijk, hoewel aanpassing van de elektrospinningparameters noodzakelijk kan zijn.
Over het algemeen beschrijft het gepresenteerde protocol een eenvoudige en kosteneffectieve manier om meerlagige hartklepblaadjes te produceren. De toepassing van 3D-printen maakt een snelle aanpassing en modificatie van de collector en de inserts mogelijk. Dit maakt de productie van patiëntspecifieke prothesen mogelijk zonder een ingewikkeld productieproces van bijvoorbeeld metalen collectoren. Meerdere monsters kunnen onder identieke omstandigheden in één run worden gemaakt. Daarom kunnen materiaalvernietigende tests worden uitgevoerd op de monsters met het voordeel dat er (bijna) identieke overblijven om de eigenlijke klep te bouwen. De opname van de afdrukbestanden als aanvullende bestanden in deze studie is bedoeld om de vooruitgang van meerlagige hartklepsteigers te ondersteunen. Deze nieuwe elektrospinningtechniek heeft ook een groot potentieel voor andere gebieden van regeneratieve geneeskunde, omdat gemodificeerde collectoren en andere 3D-geprinte, spinsjablonen eenvoudig te implementeren zijn.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projectnummer MA 2186/14-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BTC-FR2.5TN.D09 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Traction engine (Tensile tests) | |
| C5-E Motor Controller | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor controll unit | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelectronik GmbH | Power Supply Unit Anode | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelektronik GmbH | Power Supply Unit Kathode | |
| Conductive Composite PLA | ProtoPasta | Conductive PLA | |
| Cura 4.7.1 | Ultimaker BV | Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2 | |
| DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | DAPI | |
| Disposable Scalpel No. 23 | FEATHER | Scalpel | |
| Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol | Carl Roth GmbH + Co. KG | Fluorescein | |
| Fume Hood as per DIN 12924 Class 2 | Köttermann GmbH | Fume Hood | |
| Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976 | Leica Microsystems GmbH | Software for Confocal Laser Scanning Microscope | |
| Luerlock Syringe 20 mL | BD Plastipak | Luerlock Syringe | |
| Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm | Unimed S.A. | Needle with plane tip | |
| Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16" x 1/8", length 1.000 mm | Bohlender GmbH | F740-28 | Solvent resistant tubes |
| N,N-Dimethylformamide ≥99.8% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Dimethylformamide | |
| Pellethane 2363 80AE | Velox GmbH Hamburg | Polyurethane | |
| PLA | Ultimaker BV | PLA | |
| Plug&Drive Studio (1.0.4) | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor operation software | |
| SEM Evo LS 10 | Zeiss MicroImaging GmbH | Scanning Electron Microscope | |
| SHT 31-D | Adafruit Industries | Temperature and Humidity Sensor | |
| SolidWorks 2020 CAD Software | Dassault Systèmes | Commercial CAD Software | |
| Sulforhodamine 101 50 mg | Sigma - Aldrich | S 7635 | Texas Red |
| Syringe Pump Model: Fusion 100 | Chemyx Inc. | Syringe Pump | |
| TCS SP8 inverted CEL BMi8 | Leica Microsystems GmbH | Confocal Laser Scanning Microscope | |
| testXpert V11.02 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Software Tensile Test | |
| Tetrahydrofuran ≥99.9% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Tetrahydrofuran | |
| Type 1511530000202 #980361 | Binder Labortechnik GmbH | Heating Cabinet | |
| Ultimaker 3 Extended | Ultimaker BV | 3D Printer |
References
- Van Camp, G.
- Iung, B., Vahanian, A. Epidemiology of valvular heart disease in the adult. Nature Reviews Cardiology. 8 (3), 162-172 (2011).
- Fioretta, E. S., et al. Cardiovascular tissue engineering: From basic science to clinical application. Experimental Gerontology. 117 (1), 1-12 (2019).
- Xue, J., Wu, T., Dai, Y., Xia, Y. Electrospinning and electrospun nanofibers: methods, materials, and applications. Chemical Reviews. 119 (8), 5298 (2019).
- Grande, D., Ramier, J., Versace, D. L., Renard, E., Langlois, V. Design of functionalized biodegradable PHA-based electrospun scaffolds meant for tissue engineering applications. New Biotechnology. 37, Pt A 129-137 (2017).
- Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(l-lactic acid) vascular graft coated with poly(l-lactic-co-ε-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(l-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).
- Voorneveld, J., Oosthuysen, A., Franz, T., Zilla, P., Bezuidenhout, D. Dual electrospinning with sacrificial fibers for engineered porosity and enhancement of tissue ingrowth. Journal of Biomedical Material Research. 105 (6), 1559-1572 (2017).
- Kishan, A. P., Cosgriff-Hernandez, E. M. Recent advancements in electrospinning design for tissue engineering applications: A review. Journal of Biomedical Materials Research. 105 (10), 2892-2905 (2017).
- Sacks, M. S., David Merryman, W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Buchanan, R. M., Sacks, M. S. Interlayer micromechanics of the aortic heart valve leaflet. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (4), 813-826 (2014).
- Gensler, M., et al. 3D printing of bioreactors in tissue engineering: A generalised approach. PLoS One. 15 (11), 0242615 (2020).
- Grab, M., et al. Customized 3D printed bioreactors for decellularization-High efficiency and quality on a budget. Artificial Organs. 45 (12), 1477-1490 (2021).
- Huang, J., Koutsos, V., Radacsi, N. Low-cost FDM 3D-printed modular electrospray/electrospinning setup for biomedical applications. 3D Printing in Medicine. 6 (1), 8 (2020).
- Fukunishi, T., et al. Preclinical study of patient-specific cell-free nanofiber tissue-engineered vascular grafts using 3-dimensional printing in a sheep model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (4), 924-932 (2017).
- Jana, S., Lerman, A. In vivo tissue engineering of a trilayered leaflet-shaped tissue construct. Regenerative Medicine. 15 (1), 1177-1192 (2020).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomaterialia. 10 (1), 11-25 (2014).
- Wang, X., Ding, B., Yu, J., Yang, J. Large-scale fabrication of two-dimensional spider-web-like gelatin nano-nets via electro-netting. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 86 (2), 345-352 (2011).
- Yang, G. -Z., Li, H. -P., Yang, J. -H., Wan, J., Yu, D. -G. Influence of working temperature on the formation of electrospun polymer nanofibers. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 55 (2017).
- Ekaputra, A. K., Prestwich, G. D., Cool, S. M., Hutmacher, D. W. Combining electrospun scaffolds with electrosprayed hydrogels leads to three-dimensional cellularization of hybrid constructs. Biomacromolecules. 9 (8), 2097-2103 (2008).
- Motta, S. E., et al. Geometry influences inflammatory host cell response and remodeling in tissue-engineered heart valves in-vivo. Scientific Reports. 10 (1), 19882 (2020).
- Masoumi, N., et al. Tri-layered elastomeric scaffolds for engineering heart valve leaflets. Biomaterials. 35 (27), 7774-7785 (2014).
- Jana, S., Lerman, A. Behavior of valvular interstitial cells on trilayered nanofibrous substrate mimicking morphologies of heart valve leaflet. Acta Biomaterialia. 85, 142-156 (2019).
- Jana, S., Franchi, F., Lerman, A. Trilayered tissue structure with leaflet-like orientations developed through in vivo tissue engineering. Biomedical Materials. 15 (1), 015004 (2019).
- Zhou, Y., Chyu, J., Zumwalt, M. Recent progress of fabrication of cell scaffold by electrospinning technique for articular cartilage tissue engineering. International Journal of Biomaterials. 2018, 1953636 (2018).
- Zamani, M., Shakhssalim, N., Ramakrishna, S., Naji, M. Electrospinning: application and prospects for urologic tissue engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 579925 (2020).
- Heilingoetter, A., Smith, S., Malhotra, P., Johnson, J., Chiang, T. Applications of Electrospinning for Tissue Engineering in Otolaryngology. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 130 (4), 395-404 (2020).
- Xue, J., Xie, J., Liu, W., Xia, Y. Electrospun nanofibers: new concepts, materials, and applications. Accounts of Chemical Research. 50 (8), 1976-1987 (2017).
