Summary
Den presenterade metoden erbjuder ett innovativt sätt att konstruera biomimetiska fiberstrukturer i tredimensionella (3D) ställningar (t.ex. hjärtklaffbroschyrer). 3D-printade, ledande geometrier användes för att bestämma form och dimensioner. Fiberorientering och egenskaper var individuellt justerbara för varje lager. Flera prover kan tillverkas i en installation.
Abstract
Elektrospinning har blivit en allmänt använd teknik inom kardiovaskulär vävnadsteknik eftersom det ger möjlighet att skapa (mikro-) fibrösa ställningar med justerbara egenskaper. Syftet med denna studie var att skapa flerskiktade byggnadsställningar som efterliknar de arkitektoniska fiberegenskaperna hos mänskliga hjärtklaffbroschyrer med hjälp av ledande 3D-tryckta samlare.
Modeller av aortaklaffkusps skapades med hjälp av kommersiell CAD-programvara (Computer Aided Design). Ledande polymjölksyra användes för att tillverka 3D-tryckta bipacksedelmallar. Dessa cusp-negativ integrerades i en speciellt utformad, roterande elektrospinning dorn. Tre lager polyuretan snurrades på kollektorn och efterliknade fiberorienteringen hos mänskliga hjärtklaffar. Yt- och fiberstrukturen bedömdes med ett svepelektronmikroskop (SEM). Appliceringen av fluorescerande färgämne möjliggjorde dessutom mikroskopisk visualisering av den flerskiktade fiberstrukturen. Dragprovning utfördes för att bedöma byggnadsställningarnas biomekaniska egenskaper.
3D-utskrift av väsentliga delar till elektrospinningriggen var möjlig på kort tid för en låg budget. Aortaklaffens kuspar som skapades efter detta protokoll var treskiktade, med en fiberdiameter på 4,1 ± 1,6 μm. SEM-avbildning avslöjade en jämn fördelning av fibrer. Fluorescensmikroskopi avslöjade enskilda lager med olika inriktade fibrer, där varje lager exakt nådde den önskade fiberkonfigurationen. De producerade byggnadsställningarna visade hög draghållfasthet, särskilt längs inriktningsriktningen. Utskriftsfilerna för de olika samlarna finns som Supplemental File 1, Supplemental File 2, Supplemental File 3, Supplemental File 4 och Supplemental File 5.
Med ett högspecialiserat installations- och arbetsflödesprotokoll är det möjligt att efterlikna vävnader med komplexa fiberstrukturer över flera lager. Att snurra direkt på 3D-printade solfångare skapar stor flexibilitet vid tillverkning av 3D-former till låga produktionskostnader.
Introduction
Hjärt-kärlsjukdom är den vanligaste dödsorsaken i västländer 1. Även om omfattande forskning görs inom detta område uppskattas det att bördan av degenerativ hjärtklaffsjukdom kommer att öka ytterligare under de närmaste åren2. Kirurgisk eller ingripande hjärtklaffbyte är möjlig som ett terapeutiskt alternativ. Vid denna tidpunkt finns mekaniska och bioprotetiska hjärtklaffar tillgängliga, båda med individuella nackdelar. Mekaniska ventiler är trombogena och kräver livslång antikoagulering. Även om biologiska ventiler inte kräver antikoagulering, visar de brist på ombyggnad, hög förkalkningshastighet och samtidig nedbrytning3.
Vävnadskonstruerade hjärtklaffar kan kanske ta itu med dessa nackdelar genom att införa en mikrofibrös byggnadsställning i kroppen som möjliggör ombyggnad in vivo. Olika metoder, t.ex. elektrospinning (ESP), decellularisering, mikrogjutning, spray, doppbeläggning och 3D-bioprinting, finns tillgängliga. Dessa metoder kan väljas för att skapa specifika egenskaper, vara billigare och snabbare, eller bara på grund av brist på alternativ. Metoder och material kan till och med kombineras för att skapa mer komplexa strukturer4. ESP har till exempel varit en standardteknik för att skapa byggnadsställningar inom vävnadsteknik, vilket möjliggör kombinationen av olika material och justering av fiberdiametrar, fiberorienteringar och porositeter4. Dessutom möjliggör en mängd olika efterbehandlingstekniker optimerad vävnadsombyggnad, förbättrad hemokompatibilitet och justerbar biologisk nedbrytning av elektrospunna byggnadsställningar 5,6,7.
Grundläggande ESP använder antingen statiska eller roterande kollektorer, som har ett direkt inflytande på graden av fiberinriktning och de erhållna fiberdiametrarna8. På grund av tillverkningsbegränsningar består klassiska ESP-roterande samlare av roterande trummor, skivor, ledningar eller metallstavar. Införandet av 3D-printing möjliggör skapandet av mer individualiserade kollektorgeometrier som inte begränsas av traditionella tillverkningstekniker. Denna individualisering är särskilt användbar för skapandet av 3D-konstruktioner som hjärtklaffbroschyrer.
Den naturliga treskiktade (fibrosa, spongiosa, ventricularis) arkitekturen hos mänskliga hjärtklaffblad är vävnadernas svar på de mekaniska krafterna och skjuvspänningen de utsätts för under hjärtcykeln 9,10. Fibrerna i lamina fibrosa är orienterade omkrets, medan fibrerna i lamina spongiosa är slumpmässigt inriktade och de hos lamina ventricularis radiellt. Ett trippelskikt med motsvarande fiberorienteringar föreslås således för att efterlikna egenskaperna hos dessa ventiler i en vävnadskonstruerad byggnadsställning.
Arbetsflödesprotokollet beskriver en innovativ metod för att producera treskiktade 3D-hjärtklaffbroschyrer med hjälp av 3D-utskrift och elektrospinning. Dessutom presenteras ett kvalitetskontrollsteg för att säkerställa exakt fiberorientering i varje lager.
Protocol
1. Förberedande arbete
- 3D-utskrift
Följande steg kräver nedladdning av STL-filerna (Standard Triangle Language) som tillhandahålls som Supplemental File 1, Supplemental File 2, Supplemental File 3, Supplemental File 4 och Supplemental File 5 med det här manuskriptet. Samlardelar tillhandahålls som STL-filer. Den anslutande flänsen tillhandahålls som "STandard for the Exchange of Product Model Data" (STEP) -fil för att möjliggöra justering av kollektorn så att den passar enskilda inställningar. Dessutom tillhandahålls en teknisk ritning för de centrala metallstavarna för konventionell tillverkning som kompletterande fil 6.- Öppna skivprogramvaran (se materialförteckningen) och konfigurera det aktiva skrivhuvudet för icke-ledande polymjölksyra (PLA) och ett 0,4 mm munstycke.
OBS: Skivprogramvara, filament och munstycksdiameter kan variera beroende på tillgänglig 3D-skrivare. - Ladda upp STL-filerna Specimen_mount_A (Supplemental File 3) och Speciment_mount_B (Supplemental File 4) till skivprogramvaran.
- Rotera modellerna, så de triangulära ytorna placeras på byggplattan.
- Markera alla delar, högerklicka och välj Multiplicera valda modeller. Ange 1 i prompten Antal kopior och klicka på OK. Placera totalt fyra modeller på byggplattan.
- Ställ in skivtjockleken på 0,1 mm, väggtjockleken på 1 mm, fyllnadstätheten på 40 % och avmarkera rutan Generera stöd .
- Klicka på knappen Skiva | Spara i Flyttbar för att spara utskriftsfilen på en USB-enhet.
- Ladda icke-ledande PLA i skrivaren och starta utskriftsfilen.
- När utskriften är klar tar du bort modellerna från byggplattan och kontrollerar om det är vridning i de nedre hörnen.
- I skivprogramvaran behåller du materialparametrarna och ersätter modellerna med Collector_Flange (Supplemental File 1 och Supplemental File 5) och Leaflet_Template (Supplemental File 2).
- Vrid flänsen så att den plana cirkulära ytan ligger mot byggplattan. Rotera dessutom broschyrmallen så att den fyrkantiga ytan placeras direkt på byggplattan.
- Markera flänsen och multiplicera modellen som i steg 1.1.4. Typ 1 för att få 1 kopia och 1 original av flänsmodellen på byggplattan.
- Markera bipacksedelsmodellen och multiplicera med 8 för att få totalt nio bipacksedelsmodeller enligt stegen som beskrivs i 1.1.4.
- Ställ in skivtjockleken på 0,1 mm, väggtjockleken på 1 mm, fyllnadstätheten på 80 % och avmarkera rutan Generera stöd.
- Klicka på knappen Skiva | Spara i Flyttbar för att spara den nya utskriftsfilen på en USB-enhet.
- Ladda ledande PLA i skrivaren och starta utskriftsprocessen.
- När utskriften är klar tar du bort modellerna från byggplattan. Ta försiktigt bort enskilda filamentfibrer längst ner på bipacksedeln negativt med en trådskärare om dessa finns i bipacksedelmodellerna (eftersom inga stödstrukturer användes).
- Öppna skivprogramvaran (se materialförteckningen) och konfigurera det aktiva skrivhuvudet för icke-ledande polymjölksyra (PLA) och ett 0,4 mm munstycke.
- Spinning lösning
VARNING: Tetrahydrofuran (THF) och dimetylformamid (DMF) är skadliga lösningsmedel som inte ska inandas eller komma i kontakt med huden. Det rekommenderas starkt att bära lösningsmedelsbeständiga handskar och skyddsglasögon när du hanterar dem. När du hanterar dem, arbeta under en avgashuv eftersom de är extremt flyktiga.- Placera en skala under avgashuven och placera en 200 ml skruvlocksglasflaska på den. Tare skalan.
- Häll 50 ml DMF och 50 ml THF i glasflaskan. Notera lösningsmedlens vikt.
- Placera en magnetstång inuti flaskan, placera flaskan på en magnetomrörare och slå på den.
- Multiplicera den noterade vikten med 0,15 (= 15 % vikt/v) och överför motsvarande mängd polyuretan (PU) långsamt till glasflaskan som innehåller lösningsmedelsblandningen (DIN 1310).
- Stäng flaskan och rör om i minst 12 timmar vid rumstemperatur för att få en homogen lösning.
2. Inställning av elektrospinning
- Församling
OBS: Eftersom broschyrställningarna som skapats med den presenterade kollektorn är relativt små rekommenderas valfri användning av en trummandrel med stor diameter (D: 110 mm). Detta möjliggör skapandet av större, flerskiktade byggnadsställningar, vilket kommer att vara fördelaktigt för mikroskopisk, biokompatibilitet och biomekanisk bedömning.- Montera kollektorn med de 3D-utskrivna delarna och sex M3 x 15-skruvar.
- Använd tre skruvar för att fästa metallstavarna på en av flänsarna.
- Skjut en Specimen_mount_B mellan metallstängerna. Se till att mellanslagen för mallar pekar i motsatt riktning mot flänsen.
- Fyll de tre luckorna i Specimen_mount_B med mallar för hjärtklaffblad.
- Placera Specimen_mount_A ovanpå och fyll utrymmena med mallar.
- Skjut in ytterligare en Specimen_mount_A och fyll utrymmena med mallar.
- Fixa mallarna genom att lägga den andra Specimen_mount_B ovanpå.
- Sätt den andra flänsen ovanpå och använd M3-skruvarna för att säkra den.
OBS: Se till att broschyrmallarna alla är orienterade i samma riktning (rak kant på broschyren parallellt med metallstavarna). - Placera den monterade broschyruppsamlaren i elektrospinningsinställningen och fäst flänsarna ordentligt på motoraxeln (dvs. M6-skruvar och vingmuttrar) (Figur 1).
VARNING: Eftersom ledande PLA är mer spröd än vanlig PLA, använd en momentnyckel vid 1,4 Nm när du fäster bultar som sätter press på materialet för att undvika att knäppa. - Placera en nålhållare 30 cm från uppsamlaren.
- Fixa en 14 gauge (G) nål med en platt spets i nålhållaren och fixera den på höjden av kollektorns axel.
- Anslut ett flexibelt, lösningsmedelsbeständigt (t.ex. polytetrafluoretylen (PTFE)) rör till nålens Luer-låsport.
OBS: DMF och THF löser upp många plaster. Det är nödvändigt att använda lösningsmedelsbeständiga material vid arbete med dessa lösningsmedel, t.ex. metall- och glasverktyg. När plastverktyg krävs (dvs. spruta eller slang), se till att använda lösningsmedelsbeständiga material. - Led röret till sprutpumpen för senare anslutning av den polymerfyllda sprutan.
- Anslutning av nätaggregat (PSU)
VARNING: Se till att strömförsörjningen är frånkopplad från huvudströmkällan under installationen.- Anslut två skärmade högspänningskablar till strömförsörjningens anod och katod.
- Anslut kabeln som är ansluten till katoden (- polen) till 14 G-nålen med en krokodilklämma. Kontrollera anslutningen mellan klämma och nål. Styr sedan högspänningskabeln så att den går utanför snurrområdet för att undvika störningar.
- Anslut kollektorn till anoden (+ polen) med en krokodilklämma och den andra högspänningskabeln. Använd en glidring eller en glidkontakt med en avskalad kabel för att skapa kontakt vid kollektorns fläns.
- Beredning av sprutan
OBS: Detta steg bör utföras omedelbart innan snurrningsprocessen startar.- Fyll en 20 ml Luer-lock-spruta med den snurrande lösningen framställd i steg 1.2.
- Anslut sprutan till det lösningsmedelsbeständiga röret och tryck manuellt in lösningen i slangsystemet tills en droppe är synlig vid nålens spets.
- Placera sprutan i sprutpumpen. När du har slagit på pumpen anger du följande parametrar: diameter: 19.129 mm; volym: 5 ml; hastighet 3 ml/h.
3. Elektrospinning process
- Motorisk provkörning
OBS: Tillverkning av kollektorn med 3D-utskrift kan leda till rörelse utanför mitten av kollektorn. Därför rekommenderas starkt en testkörning med lägre varvtal men utan hög spänning.- Öppna motorstyrningsprogramvaran genom att dubbelklicka på ikonen på datorn.
- Anslut till motorstyrningen genom att klicka på knappen Anslut .
- När du har anslutit väljer du driftläget Profilhastighet och klickar på fliken Operation i det övre vänstra hörnet av skärmen.
- Välj fliken Profilhastighet under snabbstoppsknappen inramad av en röd linje. Skriv in följande inställningar: Målhastighet: 200 rpm; profilacceleration: 100; profilens retardation: 200; snabbstopp: 5000.
OBS: Rotationsriktningen ska vara uppåt på nålsidan, som kan justeras genom att ändra tecknet i fältet "målhastighet" från "+" till "-". - Starta testkörningen och kontrollera om det finns någon obalans i kollektorn. Om samlaren går smidigt, fortsätt med protokollet. Annars stoppar du motorn och justerar om kollektorn enligt beskrivningen i steg 2.1.9.
- Stoppa motorn genom att klicka på knappen Slå på aktiverad och ändra Målhastighet till 2 000 rpm.
- Tillverkningsprocess
OBS: Elektrospinning är en process med stort beroende av miljöparametrar. Optimala elektrospinningsresultat erhölls mellan 15-20% relativ fuktighet vid en temperatur mellan 21 och 24 °C.- Första lagret
OBS: Under installationsfasen kan en torkad droppe PU ha bildats vid nålens spets. Ta bort droppen med ett långt, icke-ledande verktyg, om det behövs.- I programvaran för motorstyrning klickar du på knappen Aktivera drift för att slå på motorn.
- Slå på högspänningsströmförsörjningen och justera spänningen för både anod och katod: minus pol (nål): 18 kV; plus pol (kollektor): 1,5 kV.
- Starta sprutpumpen med en flödeshastighet på 3 ml/h.
- Ställ in en timer på 20 min.
- Observera nålspetsen för bildandet av en skräddarsydd kon. Beroende på konens form vid nålspetsen, justera spänningen vid katoden i steg om ±100 V tills en stabil skräddarsydd kon är etablerad.
OBS: Om droppen hänger är spänningen för låg. Ostadigt flöde kan dock indikera att spänningen är inställd för hög. - Vänta i 20 minuter tills cusp-mallarna täcks tillräckligt med fibrer.
- Stäng av sprutpumpen.
- Stäng av nätaggregatet genom att vrida på strömbrytaren.
- Stoppa motorn genom att klicka på knappen Slå på aktiverad i motorstyrningsprogramvaran.
VARNING: För att förhindra skador från rörliga delar i systemet, vänta tills uppsamlaren har stannat helt för att öppna testkammaren.
- Andra lagret
- I motorstyrningsprogramvaran ändrar du inmatningsfältet Målhastighet till 10 rpm.
- Upprepa steg 3.2.1.1–3.2.1.9.
- Tredje lagret
OBS: Innan byggnadsställningarna är helt torra är de extremt känsliga för mekanisk påfrestning. Var mycket försiktig när du utför steg 3.2.3.2-3.2.3.6. Undvik att röra vid byggnadsställningarna/fibrerna under dessa steg, eftersom ställningen kan bli värdelös.- Öppna försiktigt skruvarna som förbinder kollektorflänsarna med motoraxeln och ta bort broschyruppsamlaren (figur 2B) från elektrospinningsanordningen.
- Skär de elektrospunna fibrerna längs den yttre konturen av varje broschyrmall (figur 2C) med en skalpell.
- Ta bort flänsen på ena sidan av kollektorn.
- Dra ut de 3D-utskrivna insatserna och separera bipacksedelsmallarna från de icke-ledande triangulära hållarna.
- Vrid alla broschyrmallar med 90 ° och sätt ihop kollektorn igen.
- Sätt i kollektorn i elektrospinningsinställningen och fäst den ordentligt.
- Återigen, kontrollera om det finns obalans innan du fortsätter spinnprocessen.
- I programvaran för motorstyrning ändrar du inmatningsfältet Målhastighet till 2 000 rpm.
- Upprepa steg 3.2.1.1–3.2.1.9.
OBS: Efter avslutad elektrospinningsprocess rekommenderas det starkt att spola slangen och nålen med ren DMF för att förhindra igensättning av slangen.
- Fluorescerande färgade ställningar (tillval)
OBS: Fluorescerande färgämnen används för att göra fibrerna synliga under ett konventionellt fluorescensmikroskop. Detta är endast nödvändigt när metoden implementeras och för kvalitetskontroll efter att nya inställningar har tillämpats. Användning av fluorescerande färgämnen rekommenderas inte vid tillverkning av byggnadsställningar med etablerade inställningar.- Dela den snurrande lösningen framställd i steg 1.2 i tre lika stora portioner i separata flaskor.
- Mät med hjälp av en skala 1 mg fluorescerande färgämne för varje gram (0,1 viktprocent) polymerlösning. Upprepa för alla tre fluorescerande färgämnen (dvs. fluorescein, Texas Red, 4',6-diamidino-2-fenylindol [DAPI]).
- Tillsätt färgämnet i den snurrande lösningen, stäng flasklocket och rör om i 2-3 timmar eller tills homogenisering.
OBS: För att förhindra att de fluorescerande färgämnena bleknar, skydda den snurrande lösningen från ljus så mycket som möjligt, dvs genom att placera ett ogenomskinligt lock över magnetomröraren. Processen för fluorescerande färgade ställningar är mycket lik standardprocessen som beskrivs i steg 3.2.1-3.2.3. - I steg 3.2.1 ersätter du standardsprutan med en spruta fylld med den snurrande lösningen som innehåller det första fluorescerande färgämnet.
- I steg 3.2.2 ersätter du de för närvarande använda slangarna och nålen med nya eller rengjorda. Placera sedan en spruta med den snurrande lösningen som innehåller det andra fluorescerande färgämnet i sprutpumpen.
- I steg 3.2.3 igen, byt ut slangen och nålen med nya eller rengjorda och ersätt sprutan med en som är fylld med spinnlösning som innehåller det tredje fluorescerande färgämnet.
OBS: För att undvika förseningar under tillverkningsprocessen är det fördelaktigt att använda tre uppsättningar slangar och nålar. Alternativt kan röret och nålen spolas noggrant med THF och DMF mellan produktionen av lager tills ingen spinnlösning innehållande fluorescerande färgämne finns kvar i systemet.
- Första lagret
4. Efterbehandling och provtagning
- Efterbehandling av ställningar
- Ta bort kollektorn från elektrospinningsenheten.
- Skär loss varje mall vid basen med en skalpell enligt beskrivningen i steg 3.2.3.2.
- Öppna uppsamlaren, som beskrivits ovan, och placera mallarna, bas ner, på ett fack.
- Placera brickan i ett torkskåp över natten vid 40 °C.
- När proverna är helt torkade, använd en skalpell för att noggrant skära längs kanterna på bipacksedelmallen för att ta bort överskottsfibrer.
- Skala sedan försiktigt bipacksedelns byggnadsställning på mallen och lägg den på en bricka för vidare bearbetning.
Representative Results
Detta protokoll syftar till att utveckla en trippelskiktad bipacksedelställning avsedd för användning vid kardiovaskulär vävnadsteknik av hjärtklaffar. Det efterliknar kollagenkonfigurationen av de tre skikten i den inhemska mänskliga hjärtklaffen. Varje skikt består av fibrer med en total diameter av 4,1 ± 1,6 μm (Figur 1).
Figur 1: Fiberegenskaper. Analys av fibrer: Totalt fiberantal; Diameter i μm: medelvärde, läge, standardavvikelse, minimal diameter, maximal diameter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bipacksedelsmallarna är utformade för att passa en Ø 24 mm aortaklaffprotes (figur 2C). Efter torkning behöll bipacksedelställningarna sin form av en 3D-hjärtklaff (figur 3A).
Figur 2: Elektrospinningsinställning. (A) Monterad 3D-tryckt kollektor i den roterande inställningen; (B) CAD-rendering av den 3D-utskrivbara kollektorn. (C) CAD-återgivning av den negativa bipacksedeln för hjärtklaffen som visas i B. triangel indikerar inzoomad del. Förkortning: CAD = datorstödd design. Klicka här för att se en större version av denna figur.
SEM-avbildning användes för att bedöma de inriktade och ojusterade skikten (TEMP F3512-21). Fotografier togs med 100x, 500x och 2000x förstoring på tre olika platser på en byggnadsställning. Inriktade fiberställningar visas med en slät yta och strikt orientering i omkretsriktningen (figur 3B). Visuell analys av 2000x-bilden med avseende på fiberorienteringen bekräftar fibrernas primära inriktning (Figur 3C). Ojusterade fiberställningar visar en liknande slät yta jämfört med de inriktade fibrerna. Fiberorientering är oordnad, med många framträdande korsningar mellan fibrer (Figur 3D). Efterföljande visuell analys bekräftar avinriktningen av fibrer utan någon primär orientering synlig (figur 3E).
Figur 3: Elektrospunnen bipacksedel och SEM-avbildning. (A) Elektrospunnen flerskiktad bipacksedel och 3D-tryckt broschyruppsamlare; (B) SEM-bild av ojusterade fibrer (förstoring 1000x); (C) Fiberorienteringsanalys av ojusterade fibrer; (D) SEM-bild av inriktade fibrer (förstoring 1000x); (E) Fiberorienteringsanalys av inriktade fibrer. Skalstänger = 10 mm (A), 100 μm (B, D). Förkortning: SEM = svepelektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Avbildning av fluorescerande färgade flerskiktade byggnadsställningar avslöjade tre enskilda lager med distinkta fiberorienteringar (figur 4D). Bottenskiktet (figur 4A; blått) visar inriktade fibrer i horisontell orientering med mycket liten skärningspunkt mellan fibrerna. Mellanskiktet (figur 4B; grönt) visar ojusterade fibrer utan primärfiberorientering. Det översta lagret (figur 4C; rött) visar inriktade fibrer i vinkelrät orientering. Visuell analys av de övre och nedre skikten avslöjar en genomsnittlig vinkel mellan de två skikten på 89 °, vilket överensstämmer med kollektorns 90 ° rotation under spinnprocessen (figur 4E).
Figur 4: Fluorescensmikroskopi av flerskiktad byggnadsställning. (A) Fluorescensbild av det första lagret med primär orientering från nedre vänstra till övre högra; (B) Fluorescensbild av det andra skiktet med ojusterad fiberorientering; C) Fluorescensbild av det tredje lagret med primär orientering nedifrån höger till uppe till vänster. (D) Fluorescensbild av alla tre skikten kombinerade i en byggnadsställning. (E) Fiberorienteringsanalys för alla tre skikten (Lager 1: blå; Lager 2: grönt; Lager 3: röd); förstoring = 400x (A-D); skalstänger = 100 μm (A-D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tjockleksmätning gjordes på 21 prover (figur 5A) (TEMP F3510-21). Alla prover skapades med samma parametrar. Temperatur och luftfuktighet kan skilja sig mellan 20,3 °C och 26,1 °C och 35 % respektive 55 % luftfuktighet. Resultaten visade en relativt linjär ökning av tjockleken på ~ 2,65 μm per min.
Ett annat experiment visade konsistensen av resultaten efter 60 minuters spinning under matchande parametrar (figur 5B). Luftfuktighet och temperatur kan skilja sig mellan 35 % och 50 % luftfuktighet respektive 20,3 °C till 26,1 °C. Resultatet blev ställningar mellan 126 och 181 μm i tjocklek. Den genomsnittliga tjockleken var 151,11 ± 13,17 μm. Ökningen i tjocklek var ~ 2,52 μm per min, i genomsnitt.
Figur 5: Tjockleksmätning. (A) Tjocklek på byggnadsställningar per spunnen tid; n = 21; Korrelationskoefficient (r) = 0,653; p** = 0,00132; B) Provernas tjocklek efter 60 minuter. n = 13; röd linje: medelvärde. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Dragprov för inriktade och ojusterade fiberställningar utfördes i två riktningar, längs omkretsriktningen och vinkelrätt mot den. Varje injekteringsbruk bestod av 15 exemplar. Prover togs ur flygplansställningar enligt DIN 53504:2017-03. Tjockleken mättes på tre olika ställen på varje prov och användes för att beräkna de maximala kraftvärdena per kvadrat mm.
Tjockleksvärdena låg mellan 0,03 och 0,2 mm. Jämförelsen av den ultimata draghållfastheten avslöjade en signifikant skillnad (p < 0,001) mellan orienteringar för de inriktade fiberställningarna (figur 6A). Ställningarna nådde en maximal hållfasthet på 12,26 ± 2,59 N/mm2 längs omkretsorienteringen. Draghållfastheten reducerades till 3,86 ± 1,08 N/mm2 i vinkelrät riktning.
Ojusterade fiberställningar visar ingen skillnad i den ultimata draghållfastheten för de olika orienteringarna (F1: 7,19 ± 1,75 N/mm2, F2: 7,54 ± 1,59 N/mm2; p = 0,60). Den jämförande analysen av förlängningen vid brott för de inriktade fiberställningarna avslöjade signifikanta skillnader (p < 0,001) i distensibilitet mellan riktningarna (figur 6B). Tökningsbarheten nådde 187,01 ± 39,37% i omkretsriktningen jämfört med 107,16 ± 30,04% i vinkelrät riktning.
Däremot avslöjade förlängningen vid brott för de ojusterade fibermattorna enhetlig töjbarhet i båda riktningarna (F1: 269,74 ± 24,78 % ; F2: 285,01 ± 25,58 %; p = 0,69). Representativa spänningsspänningskurvor visar stora skillnader i materialets beteende, beroende på i vilken riktning dragkraften appliceras. Ojusterade fibermattor visade linjärt elastiskt beteende, medan inriktade fibermattor visade olinjäritet i axiell riktning.
Figur 6: Dragprovning av inriktade och ojusterade fibrer. (A) Ultimat draghållfasthet för inriktade och ojusterade fibermattor i omkrets- och axiella riktningar; n = 15; (B) Töjning vid brott för inriktade och ojusterade fibermattor i omkrets- och axiella riktningar. n = 15; (C) Representativa spännings-töjningskurvor för inriktade och ojusterade byggnadsställningar, dragna i axiell respektive omkretsriktning. (***p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Mätvärden för tillverkning | |||||||||
| Namn | Material | Belopp | Total tid | Total vikt [g] | Kostnad [€ per kg] | Totalkostnad | |||
| 1 | Specimen_Mount_A | Vanlig PLA | 2 | 18:19 | 159 | 51,33 € | 8.16 € | ||
| 2 | Specimen_Mount_B | Vanlig PLA | 2 | 19:42 | 161 | 51,33 € | 8,26 € | ||
| 3 | Kollektorfläns | Ledande PLA | 2 | 10:40 | 95 | 99,98 € | 9,50 € | ||
| 4 | Leaflet_Inlet | Ledande PLA | 9 | 05:32 | 31 | 99,98 € | 3,10 € | ||
| Total | 29,02 € | ||||||||
Tabell 1: Tillverkningsmått. Tabell som anger kvantitet, tillverkningstid, mängd material som behövs och kostnader för 3D-utskrivna delar. Förkortning: PLA = polymjölksyra.
Tilläggsfil 1: Anpassningsbar kollektorfläns. Stegfil för att anpassa och skriva ut kollektorfläns. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Mall för broschyr. STL-fil för att skriva ut broschyrmall. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 3: Provmontering A. STL-fil för att skriva ut provmontering A. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 4: Provfäste B. STL-fil för att skriva ut provfäste B. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 5: Kollektorfläns. STL-fil för att skriva ut kollektorfläns. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 6: Anslutning av metallstång. Teknisk ritning för att konstruera anslutande metallstavar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Det beskrivna protokollet presenterar två innovationer inom (kardiovaskulär) vävnadsteknik: billig tillverkning av helt 3D-tryckta fantomer för elektrospinning och användningen av en mångsidig kollektor för att producera anpassningsbara, flerskiktade hjärtklaffbroschyrer.
Nyligen har 3D-utskrift blivit ett värdefullt verktyg för produktion av laboratorieutrustning, t.ex. bioreaktorer eller tillverknings- och testinställningar11,12. Därför var det möjligt att tillverka elektrospinningsinställningen som presenterades i denna studie på kort tid och för en överkomlig budget (tabell 1). Detta ligger i linje med tidigare resultat för billig produktion av elektrospinningsinställningar med hjälp av 3D-utskrift13.
Dessutom, såvitt författarna vet, är detta första gången som ett ledande 3D-utskriftsmaterial användes för att skapa en elektrospinningsuppsamlare för hjärtklaffblad. Hittills har 3D-printade kollektorer antingen tillverkats genom metalllasersintring14 eller med användning av icke-ledande polymerutskrift och efterföljande efterbehandling med en ledande beläggning15. I motsats till detta nya tillvägagångssätt har dessa förfaranden en betydande nackdel eftersom de är dyrare, tar mycket längre tid eller kräver mer manuellt arbete.
Elektrospinning beror på en mängd variabler som påverkar morfologin hos de skapade fibrerna. Även om olika kommersiella elektrospinningsinställningar finns tillgängliga på marknaden, använder många forskargrupper mycket individualiserade inställningar för att matcha deras specifika behov16. Med hänsyn till detta kan de beskrivna värdena i detta protokoll (spänning, avstånd och rotationshastighet) behöva anpassas för enskilda inställningar och bör ses som en utgångspunkt snarare än fasta värden. Vidare är det känt att miljöparametrar kan ha ett betydande inflytande på elektrospinningsresultat 17,18. Därför rekommenderas det starkt att kontrollera åtminstone temperatur och fuktighet i elektrospinningriggen. Optimala elektrospinningsresultat erhölls mellan 15-20% relativ fuktighet vid en temperatur mellan 21 och 24 °C. För att följa detta protokoll är följande utrustning nödvändig: en motor som kan accelerera en kollektor som väger cirka 300 g till en varvtal på 2 000 rpm, en sprutpump som är lämplig för små volymflöden på 1-3 ml / h och en dubbelpolig strömförsörjningsenhet som kan ±20 kV likström (DC).
I linje med tidigare studier var det möjligt att visualisera den fibrösa strukturen hos de elektrospunna byggnadsställningarna genom fluorescensmikroskopi19. Det var möjligt att framgångsrikt demonstrera ställningens flerskiktade struktur, inklusive de varierande fiberorienteringarna. Speciellt när man arbetar med flera lager eller flera material bör införandet av fluorescerande färgämnen betraktas som ett standardförfarande för strikt kvalitetskontroll. Det kan förbättra den visuella bedömningen av resultat efter ändringar i parametrarna eller arbetsflödesprotokollet. Applicering av färgämne i byggnadsställningar som ska användas för in vivo - eller in vitro-bedömning kan inte rekommenderas. Detta är viktigt för att undvika störningar i etablerade analysmetoder.
Att efterlikna naturlig hjärtklaffmorfologi är av stor betydelse för att producera en vävnadskonstruerad replikat som ska användas som hjärtklaffprotes (figur 4B). Det har visat sig att den specifika ventilgeometrin har stor inverkan på in vivo-ombyggnad 20. I detta sammanhang är 3D-utskrift av bipacksedelgeometrin för elektrospinning en fördel, eftersom iterationer är enkla och snabba att implementera. Även produktion av personliga ventilgeometrier är tänkbar och efterföljande utveckling av individuella och personliga 3D-modeller av hjärtklaffavvikelser, till exempel för undervisningsändamål, är möjlig.
Ytterligare förbättring av vävnadskonstruerade hjärtklaffegenskaper står i centrum för nuvarande forskningsinsatser, eftersom flera forskargrupper har arbetat med att utveckla flerskiktade ställningar med definierade fiberorienteringar. tillverkade kompositställningar från ett gjutet polyglycerolebakatskikt och elektrospunna polykaprolakton (PCL) fibermattor21. Således kan ett trippelskikt skapas av två orienterade elektrospunna skikt åtskilda av ett ark mikrofabricerat polyglycerolsebakat. Men i motsats till byggnadsställningarna till hands var de varken i 3D-form eller efterliknade tillräckligt mellanskiktet (spongiosa). Ett annat tillvägagångssätt för att producera en bioinspirerad vävnadskonstruerad hjärtklaff följdes av Jana et al.22,23. De producerade framgångsrikt trippelskiktade ställningar med orienterade fibrer med aluminiumsamlare för PCL-baserad elektrospinning. Återigen presenterade dessa byggnadsställningar också morfologiska brister, eftersom de bara har ett 2D-utseende, och den slutliga ställningen genomsyras av ekrar.
Även om protokollet ger detaljerad information om hur 3D, trippelskiktade hjärtklaffbroschyrer produceras, finns det flera fler steg som behövs för att skapa en verklig hjärtklaffprotes. En stent med 24 mm diameter rekommenderas för de broschyrer som beskrivs här. Komplement till den använda stenten kan broschyrerna förses med ytterligare stödstrukturer för sömnad. För att möjliggöra maximal flexibilitet är broschyrerna som visas här inte individualiserade till en specifik stentdesign. Detta kan göras genom att helt enkelt ändra mallen med CAD-programvara.
Även om den används för hjärtklaffvävnadsteknik, kommer den presenterade metoden att vara lätt tillämplig för elektrospinningsinställningar inom ortopedi24, urologi25, otolaryngologi26 och andra. Produktionen av sofistikerade och / eller individualiserade 3D-konstruktioner är möjlig genom implementering av andra 3D-tryckta samlare. Även om kollektorns material har förändrats förblir principen om elektrospinning intakt27. Därför är användningen av olika polymerer teoretiskt möjlig, även om justering av elektrospinningsparametrarna kan vara nödvändig.
Sammantaget beskriver det presenterade protokollet ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att tillverka flerskiktade hjärtklaffbroschyrer. Tillämpningen av 3D-utskrift möjliggör snabb anpassning och modifiering av kollektorn och insatserna. Detta möjliggör produktion av patientspecifika proteser utan en komplicerad tillverkningsprocess av till exempel metallsamlare. Flera exempel kan skapas i en körning under identiska förhållanden. Därför kan materialförstörande tester utföras på proverna med fördelen att de har (nästan) identiska kvar för att bygga den faktiska ventilen. Införandet av utskriftsfilerna som kompletterande filer i denna studie är tänkt att stödja utvecklingen av flerskiktade hjärtklaffsställningar. Denna nya elektrospinningsteknik har också en hög potential för andra områden inom regenerativ medicin, eftersom modifierade samlare och andra 3D-tryckta, snurrande mallar är lätta att implementera.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), finansierat av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation), projektnummer MA 2186/14-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BTC-FR2.5TN.D09 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Traction engine (Tensile tests) | |
| C5-E Motor Controller | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor controll unit | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelectronik GmbH | Power Supply Unit Anode | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelektronik GmbH | Power Supply Unit Kathode | |
| Conductive Composite PLA | ProtoPasta | Conductive PLA | |
| Cura 4.7.1 | Ultimaker BV | Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2 | |
| DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | DAPI | |
| Disposable Scalpel No. 23 | FEATHER | Scalpel | |
| Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol | Carl Roth GmbH + Co. KG | Fluorescein | |
| Fume Hood as per DIN 12924 Class 2 | Köttermann GmbH | Fume Hood | |
| Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976 | Leica Microsystems GmbH | Software for Confocal Laser Scanning Microscope | |
| Luerlock Syringe 20 mL | BD Plastipak | Luerlock Syringe | |
| Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm | Unimed S.A. | Needle with plane tip | |
| Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16" x 1/8", length 1.000 mm | Bohlender GmbH | F740-28 | Solvent resistant tubes |
| N,N-Dimethylformamide ≥99.8% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Dimethylformamide | |
| Pellethane 2363 80AE | Velox GmbH Hamburg | Polyurethane | |
| PLA | Ultimaker BV | PLA | |
| Plug&Drive Studio (1.0.4) | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor operation software | |
| SEM Evo LS 10 | Zeiss MicroImaging GmbH | Scanning Electron Microscope | |
| SHT 31-D | Adafruit Industries | Temperature and Humidity Sensor | |
| SolidWorks 2020 CAD Software | Dassault Systèmes | Commercial CAD Software | |
| Sulforhodamine 101 50 mg | Sigma - Aldrich | S 7635 | Texas Red |
| Syringe Pump Model: Fusion 100 | Chemyx Inc. | Syringe Pump | |
| TCS SP8 inverted CEL BMi8 | Leica Microsystems GmbH | Confocal Laser Scanning Microscope | |
| testXpert V11.02 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Software Tensile Test | |
| Tetrahydrofuran ≥99.9% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Tetrahydrofuran | |
| Type 1511530000202 #980361 | Binder Labortechnik GmbH | Heating Cabinet | |
| Ultimaker 3 Extended | Ultimaker BV | 3D Printer |
References
- Van Camp, G.
- Iung, B., Vahanian, A. Epidemiology of valvular heart disease in the adult. Nature Reviews Cardiology. 8 (3), 162-172 (2011).
- Fioretta, E. S., et al. Cardiovascular tissue engineering: From basic science to clinical application. Experimental Gerontology. 117 (1), 1-12 (2019).
- Xue, J., Wu, T., Dai, Y., Xia, Y. Electrospinning and electrospun nanofibers: methods, materials, and applications. Chemical Reviews. 119 (8), 5298 (2019).
- Grande, D., Ramier, J., Versace, D. L., Renard, E., Langlois, V. Design of functionalized biodegradable PHA-based electrospun scaffolds meant for tissue engineering applications. New Biotechnology. 37, Pt A 129-137 (2017).
- Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(l-lactic acid) vascular graft coated with poly(l-lactic-co-ε-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(l-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).
- Voorneveld, J., Oosthuysen, A., Franz, T., Zilla, P., Bezuidenhout, D. Dual electrospinning with sacrificial fibers for engineered porosity and enhancement of tissue ingrowth. Journal of Biomedical Material Research. 105 (6), 1559-1572 (2017).
- Kishan, A. P., Cosgriff-Hernandez, E. M. Recent advancements in electrospinning design for tissue engineering applications: A review. Journal of Biomedical Materials Research. 105 (10), 2892-2905 (2017).
- Sacks, M. S., David Merryman, W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Buchanan, R. M., Sacks, M. S. Interlayer micromechanics of the aortic heart valve leaflet. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (4), 813-826 (2014).
- Gensler, M., et al. 3D printing of bioreactors in tissue engineering: A generalised approach. PLoS One. 15 (11), 0242615 (2020).
- Grab, M., et al. Customized 3D printed bioreactors for decellularization-High efficiency and quality on a budget. Artificial Organs. 45 (12), 1477-1490 (2021).
- Huang, J., Koutsos, V., Radacsi, N. Low-cost FDM 3D-printed modular electrospray/electrospinning setup for biomedical applications. 3D Printing in Medicine. 6 (1), 8 (2020).
- Fukunishi, T., et al. Preclinical study of patient-specific cell-free nanofiber tissue-engineered vascular grafts using 3-dimensional printing in a sheep model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (4), 924-932 (2017).
- Jana, S., Lerman, A. In vivo tissue engineering of a trilayered leaflet-shaped tissue construct. Regenerative Medicine. 15 (1), 1177-1192 (2020).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomaterialia. 10 (1), 11-25 (2014).
- Wang, X., Ding, B., Yu, J., Yang, J. Large-scale fabrication of two-dimensional spider-web-like gelatin nano-nets via electro-netting. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 86 (2), 345-352 (2011).
- Yang, G. -Z., Li, H. -P., Yang, J. -H., Wan, J., Yu, D. -G. Influence of working temperature on the formation of electrospun polymer nanofibers. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 55 (2017).
- Ekaputra, A. K., Prestwich, G. D., Cool, S. M., Hutmacher, D. W. Combining electrospun scaffolds with electrosprayed hydrogels leads to three-dimensional cellularization of hybrid constructs. Biomacromolecules. 9 (8), 2097-2103 (2008).
- Motta, S. E., et al. Geometry influences inflammatory host cell response and remodeling in tissue-engineered heart valves in-vivo. Scientific Reports. 10 (1), 19882 (2020).
- Masoumi, N., et al. Tri-layered elastomeric scaffolds for engineering heart valve leaflets. Biomaterials. 35 (27), 7774-7785 (2014).
- Jana, S., Lerman, A. Behavior of valvular interstitial cells on trilayered nanofibrous substrate mimicking morphologies of heart valve leaflet. Acta Biomaterialia. 85, 142-156 (2019).
- Jana, S., Franchi, F., Lerman, A. Trilayered tissue structure with leaflet-like orientations developed through in vivo tissue engineering. Biomedical Materials. 15 (1), 015004 (2019).
- Zhou, Y., Chyu, J., Zumwalt, M. Recent progress of fabrication of cell scaffold by electrospinning technique for articular cartilage tissue engineering. International Journal of Biomaterials. 2018, 1953636 (2018).
- Zamani, M., Shakhssalim, N., Ramakrishna, S., Naji, M. Electrospinning: application and prospects for urologic tissue engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 579925 (2020).
- Heilingoetter, A., Smith, S., Malhotra, P., Johnson, J., Chiang, T. Applications of Electrospinning for Tissue Engineering in Otolaryngology. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 130 (4), 395-404 (2020).
- Xue, J., Xie, J., Liu, W., Xia, Y. Electrospun nanofibers: new concepts, materials, and applications. Accounts of Chemical Research. 50 (8), 1976-1987 (2017).
