Zebrafish Corneal Wound Healing: van abrasie tot wond closure imaging analyse
Summary
Dit protocol richt zich op het beschadigen van het oculaire oppervlak van zebravissen door middel van slijtage om de daaropvolgende wondsluiting op cellulair niveau te beoordelen. Deze benadering maakt gebruik van een oculaire braam om het hoornvliesepitheel gedeeltelijk te verwijderen en maakt gebruik van scanning elektronenmicroscopie om veranderingen in de celmorfologie tijdens wondsluiting te volgen.
Abstract
Als het transparante oppervlak van het oog is het hoornvlies instrumenteel voor helder zicht. Vanwege de locatie is dit weefsel gevoelig voor omgevingsbeledigingen. Inderdaad, de oogletsels die het vaakst klinisch worden aangetroffen, zijn die aan het hoornvlies. Hoewel hoornvlieswondgenezing uitgebreid is bestudeerd bij kleine zoogdieren (d.w.z. muizen, ratten en konijnen), hebben hoornvliesfysiologiestudies andere soorten verwaarloosd, waaronder zebravissen, ondanks dat zebravissen een klassiek onderzoeksmodel zijn.
Dit rapport beschrijft een methode voor het uitvoeren van een hoornvliesslijtage op zebravissen. De wond wordt in vivo uitgevoerd op verdoofde vissen met behulp van een oculaire braam. Deze methode zorgt voor een reproduceerbare epitheliale wond, waardoor de rest van het oog intact blijft. Na slijtage wordt de wondsluiting in de loop van 3 uur gecontroleerd, waarna de wond opnieuw wordt gepipitheliseerd. Door gebruik te maken van scanning elektronenmicroscopie, gevolgd door beeldverwerking, kunnen de epitheelcelvorm en apicale uitsteeksels worden onderzocht om de verschillende stappen tijdens het sluiten van hoornvliesepitheelwonden te bestuderen.
De kenmerken van het zebravismodel maken het mogelijk om de epitheelweefselfysiologie en het collectieve gedrag van de epitheelcellen te bestuderen wanneer het weefsel wordt uitgedaagd. Bovendien kan het gebruik van een model dat verstoken is van de invloed van de traanfilm nieuwe antwoorden opleveren met betrekking tot de reactie van het hoornvlies op stress. Ten slotte maakt dit model ook de afbakening mogelijk van de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij epitheelweefsel dat wordt blootgesteld aan een fysieke wond. Deze methode kan worden toegepast op de evaluatie van de effectiviteit van geneesmiddelen in preklinische tests.
Introduction
Omdat de meeste epithelia in contact staan met de externe omgeving, zijn ze gevoelig voor lichamelijk letsel, waardoor ze zeer geschikt zijn voor de studie van wondgenezingsprocessen. Onder de goed bestudeerde weefsels is het hoornvlies een uiterst nuttig model bij het onderzoek naar de cellulaire en moleculaire aspecten van wondgenezing. Als transparant extern oppervlak biedt het fysieke bescherming aan het oog en is het het eerste element dat het licht op het netvlies richt. Hoewel de structuur en celsamenstelling van het netvlies verschillen tussen soort1, zijn deze elementen van het hoornvlies over het algemeen vergelijkbaar in alle camera-achtige ogen, ongeacht de soort.
Het hoornvlies bestaat uit drie hoofdlagen2. De eerste en buitenste laag is het epitheel, dat voortdurend wordt vernieuwd om de transparantie ervan te garanderen. De tweede laag is het stroma, dat verspreide cellen bevat, keratocyten genaamd, in een dikke laag strikt georganiseerde collageenvezels. De derde en binnenste laag is het endotheel, dat voedings- en vloeistofdiffusie van de voorste kamer naar de buitenste lagen mogelijk maakt. De epitheel- en stromale cellen interageren via groeifactoren en cytokines3. Deze interactie wordt benadrukt door de snelle apoptose en de daaropvolgende proliferatie van keratocyten na epitheliaal letsel 4,5. Bij een diepere wond, zoals een punctie, nemen keratocyten actief deel aan het genezingsproces6.
Omdat ze in contact zijn met de externe omgeving, komen lichamelijke verwondingen van het hoornvlies vaak voor. Veel van hen worden veroorzaakt door kleine vreemde voorwerpen7, zoals zand of stof. De reflex van oogwrijven kan leiden tot uitgebreide epitheliale schaafwonden en cornea-remodellering8. Afhankelijk van de wondgrootte en -diepte zijn deze fysieke verwondingen pijnlijk en duurt het enkele dagen om te genezen9. De optimale wondgenezingskenmerken van een model vergemakkelijken het begrip van de cellulaire en moleculaire aspecten van wondsluiting. Bovendien zijn dergelijke modellen ook nuttig gebleken voor het testen van nieuwe moleculen met het potentieel om de genezing van het hoornvlies te versnellen, zoals eerder is aangetoond10,11.
Het hier beschreven protocol heeft tot doel zebravissen te gebruiken als een relevant model om hoornvliesletsel te bestuderen. Dit model is zeer geschikt voor farmacologische screeningstudies omdat het moleculen mogelijk maakt om rechtstreeks aan het tankwater toe te voegen en daarom in contact te komen met een genezend hoornvlies. De details die hier worden verstrekt, zullen wetenschappers helpen hun studies over het zebravismodel uit te voeren. De in vivo verwonding wordt uitgevoerd met een afgestompte oculaire braam. De impact op epitheelcellen die eraan grenzen of op afstand ervan liggen, kan worden geanalyseerd door specifiek het centrale hoornvliesepitheel te verwijderen. In de afgelopen jaren richtten talrijke rapporten zich op een dergelijke methode op het hoornvlies van knaagdieren 12,13,14,15,16,17; tot op heden heeft echter slechts één rapport deze methode toegepast op zebravissen18.
Vanwege zijn eenvoud is de fysieke wond nuttig bij het afbakenen van de rol van epitheelcellen bij wondsluiting. Een ander bekend model van hoornvliesletsel is de chemische verbranding, met name de alkaliverbranding 19,20,21. Een dergelijke benadering beschadigt echter indirect het hele oogoppervlak, inclusief het perifere hoornvlies en het hoornvliesstroma19. Inderdaad, alkalibrandwonden induceren mogelijk hoornvlieszweren, perforaties, epitheliale opacificatie en snelle neovascularisatie22, en de oncontroleerbare uitkomst van alkalibrandwonden diskwalificeert die benadering voor algemene wondgenezingsstudies. Tal van andere methoden worden ook gebruikt om hoornvlieswondgenezing te onderzoeken volgens de specifieke focus van de studie in kwestie (bijv. Volledig epitheeldebridement23, de combinatie van chemisch en mechanisch letsel voor wond met gedeeltelijke dikte24, excimeerlaserablatie voor wonden die zich uitstrekken tot het stroma25). Het gebruik van een oculaire braam beperkt het brandpunt tot de epitheliale respons op de wond en zorgt voor een zeer reproduceerbare wond.
Zoals bij elke methode van wondtoebrengen, heeft het gebruik van een oculaire braam voor- en nadelen. Het grootste nadeel is dat de respons meestal epitheeliaal is, het weerspiegelt niet perfect de schaafwonden die in de klinische setting worden gezien. Deze methode heeft echter tal van voordelen, waaronder het gemak waarmee het kan worden opgezet en uitgevoerd, de precisie, de reproduceerbaarheid en het feit dat het niet-invasief is, waardoor het een methode is die goed wordt verdragen door dieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cornea lichamelijk letsel is de meest voorkomende oorzaak van oogheelkundige patiëntbezoeken aan het ziekenhuis. Daarom is het belangrijk om relevante modellen vast te stellen voor de studie van verschillende aspecten van cornea-pathofysiologie. Tot nu toe is de muis het meest gebruikte model voor de studie van hoornvlieswondgenezing. Het toevoegen van oogdruppels op muriene gewonde ogen om de impact van specifieke geneesmiddelen op de genezing van hoornvlieswonden te valideren, kan echter moeilijk zijn. In dit opzicht …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Pertti Panula voor de toegang tot de Zebraviseenheid en Henri Koivula voor de begeleiding en hulp bij de zebravisexperimenten. Dit onderzoek werd ondersteund door de Academie van Finland, de Jane and Aatos Erkko Foundation, de Finnish Cultural Foundation en het ATIP-Avenir Program. Beeldvorming werd uitgevoerd op de elektronenmicroscopie-eenheid en de lichtmicroscopie-eenheid, Instituut voor Biotechnologie, ondersteund door HiLIFE en Biocenter Finland.
Materials
| 0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
| 0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
| 0.5mm burr tips | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 1M Tris, pH 8.8 | in-house | ||
| adhesive tabs | Agar Scientific | G3347N | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Cotton swaps | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
| Dissecting plate | in-house | ||
| Dissecting tools | Fine Science Tools | ||
| double-distilled water | in-house | ||
| Eppedorf tubes, 2ml | any provider | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | Caution: causes irritation. |
| Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I | Sigma | G7651 | Caution: toxic. |
| Lidocaine hydrochloride | Sigma | L5647 | Caution: toxic. |
| mounts | Agar Scientific | G301P | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| pH indicator strips | Macherey-Nagel | 92110 | |
| Plastic spoons | any provider | ||
| Plastic tubes, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Plastic tubes, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Scanning electron microscope | FEI | Quanta 250 FEG | |
| Soft sponge | any provider | ||
| Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
| Stereomicroscope | Leica |
References
- Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).
- Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. Cornea and sclera: Anatomy and physiology. Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).
- Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. Stromal-epithelial interactions in the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).
- Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
- Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).
- Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. Corneal abrasions and corneal foreign bodies. Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).
- Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).
- Wilson, S. A., Last, A. Management of corneal abrasions. American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).
- Nagata, M., et al. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Scientific Reports. 5, 14776 (2015).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).
- Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).
- Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
- Park, M., et al. Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing. Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).
- Kuony, A., et al. Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop. Development. 146 (14), (2019).
- Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
- Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure. Scientific Reports. , (2021).
- Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).
- Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse. Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).
- Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
- Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. Ocular chemical injuries and their management. Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).
- Pal-Ghosh, S. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- Chen, J. J., Tseng, S. C. Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).
- Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).
- . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).
- Parlanti, P., et al. Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study. Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).
- Zhao, X. C., et al. The zebrafish cornea: structure and development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).
- Richardson, R., et al. Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals. Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).
- van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Hu, X., et al. Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing. Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).
- Ksander, B. R., et al. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair. Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
