Summary
Her præsenterer vi en protokol, der beskriver kulturen af hunde intestinale organoider i et dobbeltkammer, permeabelt støttesystem. Organoid såning i de permeable understøtninger, monolagsvedligeholdelsen og efterfølgende lægemiddelpermeabilitetseksperimenter beskrives.
Abstract
Det permeable støttesystem bruges typisk sammen med traditionelle todimensionelle (2D) cellelinjer som et in vitro-værktøj til evaluering af den orale permeabilitet af nye terapeutiske lægemiddelkandidater. Imidlertid har brugen af disse konventionelle cellelinjer begrænsninger, såsom ændret ekspression af tætte kryds, delvis celledifferentiering og fraværet af centrale nukleare receptorer. På trods af disse mangler er Caco-2- og MDCK-modellerne bredt accepteret og valideret til forudsigelse af human in vivo oral permeabilitet.
Hunde er en relevant translationel model for biomedicinsk forskning på grund af deres ligheder i gastrointestinal anatomi og intestinal mikroflora med mennesker. Derfor og til støtte for parallel lægemiddeludvikling er udarbejdelsen af et effektivt og præcist in vitro-værktøj til forudsigelse af in vivo-lægemiddelpermeabilitetsegenskaber både hos hunde og mennesker yderst ønskelig. Et sådant værktøj kunne være hundens intestinale organoidsystem, der er kendetegnet ved tredimensionale (3D), selvmonterede epitelstrukturer afledt af voksne stamceller.
(1) Permeable Support Seeding Protocol beskriver forsøgsmetoderne til dissociering og såning af hundeorganoider i indsatserne. Hundeorganoidisolering, kultur og høst er tidligere blevet beskrevet i et separat sæt protokoller i dette særnummer. Metoder til generel vedligeholdelse af hundeorganoid monolag diskuteres grundigt i (2) Monolayer Maintenance Protocol. Derudover beskriver denne protokol metoder til vurdering af monolagets strukturelle integritet via transepitelial elektrisk modstand (TEER) målinger og lysmikroskopi. Endelig beskriver (3) Permeabilitetsforsøgsprotokollen de opgaver, der går direkte forud for et forsøg, herunder in vitro-validering af forsøgsresultater.
Samlet set overvinder hundeorganoidmodellen kombineret med en dobbeltkammercellekulturteknologi begrænsninger forbundet med 2D-eksperimentelle modeller og forbedrer derved pålideligheden af forudsigelser af den tilsyneladende orale permeabilitet af terapeutiske lægemiddelkandidater både hos hunden og den menneskelige patient.
Introduction
Permeable støttesystemer bruges typisk til at bestemme den tilsyneladende permeabilitet af terapeutiske lægemiddelkandidater gennem tarmepitelbarrieren 1,2. De kan også anvendes til at vurdere cellulær sekretion3, cellemigration4 og lægemiddeltoksicitet5. In vitro orale lægemiddelpermeabilitetsassays er et vigtigt skridt i lægemiddelopdagelses- og udviklingsprocessen2, hvor individuelle lægemiddelkandidater testes i den tidlige fase af lægemidlets F&U-livscyklus6. Det permeable støttesystem er et dobbeltkammercellekulturapparat bestående af en indsats med en halvporøs membran placeret i en multiwell-plade. Dette system giver direkte adgang til de apikale og basolaterale sider af et cellemonolag dyrket i indsatsen7. Monolaget, der anvendes i disse systemer, er typisk afledt af gastrointestinale epitelceller (f.eks. Human kolorektal adenocarcinom Caco-2 cellelinje)8. Cellekulturer vokser i en polariseret tilstand, der efterligner den naturlige mikroarkitektur af tarmepitelceller, hvilket muliggør yderligere cellulær differentiering, lignende mikroanatomi og funktion7. Detaljer om den permeable støtteindsats findes i figur 1. Såning af indlæggene med 2D-cellekulturer, der traditionelt anvendes til vurdering af intestinal lægemiddelpermeabilitet, er relativt overkommelig og let at dyrke9. Disse systemer har flere store begrænsninger, herunder deres begrænsede kapacitet til at forudsige tarmmetabolismen hos terapeutiske lægemiddelkandidater10,11. Dette gælder for alle mekanismer for lægemiddelabsorption, det være sig passiv absorption gennem de tætte kryds mellem epitelceller, aktiv transepitelabsorption gennem efflux eller optagelsestransportører (f.eks. P-glycoprotein, monocarboxylattransportør 1) og lægemidler, der metaboliseres af enterocytter.
Hunde deler et fælles miljø og kost med mennesker12. Hundes tarmanatomi og mikrobiomsammensætning ligner megetmenneskets 13, som er blevet tilskrevet domesticering og delte kostvaner i løbet af de sidste 36.000 år14. Desværre kan disse ligheder også være almindelige årsager / udløsere til sygdomsudvikling. Hunde udvikler lignende kroniske sygeligheder som mennesker, såsom fedme15, inflammatorisk tarmsygdom16, kolorektal adenocarcinom17, gastrointestinal stromal tumor (GIST)18 og forskellige andre patologier forbundet med deres relative levetid19. Derfor kan hundeorganoider med succes anvendes til omvendt translationel forskning af disse kroniske multifaktorielle sygdomme i ånden i One Health Initiative20.
Caco-2-celler er de mest anvendte cellelinjer til lægemiddel oral absorptionsassays21. Disse celler betragtes i øjeblikket som "guldstandard" -modellen til in vitro intestinale permeabilitetsassays 2,22,23. Caco-2-cellelinjen udtrykker efflux- og optagelsestransportører, der findes i den menneskelige tarmkanal, skønt ved forskellige ekspressionsniveauer 24,25,26. Caco-2-celler anvendes også i vid udstrækning som modeller til at afgøre, om et lægemiddel er et substrat eller inhibitor af intestinale effluxtransportører22,27. Selvom Caco-2-cellerne er af kolonoprindelse, efterligner de en enterocytcelle. Desværre repræsenterer Caco-2-celler kun en celletype fra epitellaget i tyndtarmen9, som ikke rekapitulerer den komplekse tarmepitelcelletypesammensætning nøjagtigt. For eksempel er bægerceller dedikeret til slimproduktion fraværende i Caco-2-kulturer, således at slim-lægemiddelinteraktioner ikke kan vurderes uden samkultur med andre cellelinjer28. Desuden udtrykker Caco-2-kulturer ikke flere af de vigtige nukleare receptorer, der typisk er til stede i tarmen, såsom graviditet X-receptor (PXR), steroid X-receptor (SXR) og konstitutiv androstanreceptor (CAR)29. Følgelig undlader Caco-2-kulturer at modellere induktionen af lægemiddeltransportører og enzymer af visse lægemidler, der er inducere af disse receptorer (f.eks. Rifampin)30.
3D-tarmorganoidteknologien adresserer nogle af disse begrænsninger19. Organoider er selvsamlede konstruktioner afledt af voksne stamceller, der kan etableres fra vævsprøver høstet ved hjælp af mikroinvasive teknikker20. Humaninducerede pluripotente stamceller anvendes til modeller for tarmpermeabilitet31,32. Hundeorganoider udgør et relevant alternativ til humane organoider, fordi human stamcelleforskning er begrænset af etiske spørgsmål33. Desuden giver hundeorganoider et in vitro-system til udforskning af hundes lægemiddelpermeabilitet, metabolisme, aktiv transport og lægemiddelinteraktioner. For at løse dette teknologigab er den konsekvente og pålidelige vækst af hundes tarmorganoider i et permeabelt støttesystem blevet beskrevet34. Et permeabilitetsassay med hunde intestinale organoider kan potentielt forudsige hundes intestinale permeabilitet og metabolisme af små lægemiddelmolekyler sammenlignet med aktuelt anvendte assays (Caco-2). Bekræftelse af disse centrale træk giver dette nye in vitro-system til fremtidigt arbejde, der undersøger induceres potentielle indvirkning på intracellulær metabolisme og aktiv transport.
Hundeorganoider er sammensat af alle de celletyper, der typisk er til stede i tarmens epitellag. Fra et funktionelt og mikroanatomisk synspunkt replikerer de pålideligt miljøet i epitellaget i hundens tarm19,35. Desuden er tilstedeværelsen af slim, hundespecifikke lægemiddeltransportører og enzymer og den samlede cellulære differentiering i hundes tarmorganoider sammenlignelig med det, der ses in vivo hos hunde34. Organoider kan således isoleres fra syge veterinærpatienter og bruges til at modellere effekten af forskellige sygdomsprocesser (f.eks. Kronisk tarmbetændelse) på hunde oral lægemiddelpermeabilitet19,36. Hundens intestinale organoidsystem kan også bruges i andre indstillinger end lægemiddelpermeabilitetseksperimenter. Disse 3D-strukturer kan også isoleres fra syge patienter som tidligere beskrevet af Chandra et al. for inflammatorisk tarmsygdom, kolorektal adenocarcinom og gastrointestinal stromal tumor19.
Permeable Support Seeding Protocol beskriver metoder til etablering af hundes tarmorganoidkulturer i indsatserne. Denne første protokol skitserer metoder til at dissociere etablerede hundeorganoidkulturer belagt i den ekstracellulære membranmatrix. Desuden diskuteres forbelægningen af indsatserne med kollagen I og den ekstracellulære membranmatrix i denne protokol. Indlejring af hundeorganoider i de permeable støtteindsatser er også beskrevet detaljeret.
Den anden protokol er Monolayer Maintenance Protocol, som omfatter generel vedligeholdelse af hunde 3D-organoider belagt i en indsats. Hyppigheden og volumenerne af de organoidmedier, der bruges til at opdatere kulturen, og måder at forhindre cellekulturskader på, præsenteres i denne anden protokol sammen med eksperimentelle metoder til vurdering af sammenløbet af epitelmonolaget.
Endelig fokuserer Permeabilitetseksperimentprotokollen på måder at afgøre, om hundens intestinale 3D-organoider i et permeabilitetsassay er klar til eksperimentel brug og de verifikationstrin, der er nødvendige, før der udføres et eksperiment. Dette afsnit beskriver også opsætningen og den vellykkede udførelse af et permeabilitetseksperiment sammen med inkubation og prøveudtagning af terapeutiske lægemiddelkandidater i kamrene i monolagskulturen. Anvendelsen af fluoresceinisothiocyanat med lav permeabilitet (FITC-dextran) til overvågning af monolagsintegritet diskuteres også. Endelig beskrives en in vitro-evalueringsmetode til validering af resultaterne efter afslutningen af et forsøg. Permeabilitetseksperimenter er et ekstremt stort emne og er meget godt opsummeret af Hubatsch et al.37. Protokollernes arbejdsgang er opsummeret i figur 2.
Figur 1: Hunde intestinale organoider på et permeabelt støttesystem. Den permeable støtteindsats er placeret i en brønd på en 24-brøndplade. Den mikroporøse membran muliggør såning af dissocierede hunde intestinale organoider, og disse celler vil til sidst danne et organoid 2D monolag. Denne teknologi giver adgang til både AP- og BL-siderne af monolaget. Organoid medium introduceres i både AP- og BL-kamrene i den permeable støtte. Absorptionen (AP→BL) og sekretionen (BL→AP) af lægemiddelkandidaten er illustreret, samt to mulige former for lægemiddeltransport. Forkortelser: AP = apikal; BL = basolateral. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Arbejdsgang af hundeorganoide permeable supportprotokoller. Den permeable støtteindsats er forbelagt med en blanding af den ekstracellulære membranmatrix og kollagen I og inkuberet i 1 time. Under inkubationsprocessen dissocieres organoidkulturen. Individuelle organoidceller podes i indsatsen, medium i det basolaterale kammer tilsættes umiddelbart efter såning, mens medium til det apikale kammer tilsættes 24 timer efter såningsprocessen er afsluttet. Vedligeholdelse og overvågning af organoiderne omfatter regelmæssige mediumændringer, TEER-værdimålinger og lysmikroskopi for at evaluere monolagets integritet. Før eksperimentet skal organoiderne differentieres ved at fjerne ROCK-hæmmer og GSKiβ fra mediet. TEER-værdierne måles på dagen for eksperimentet, og det organoide monolag inspiceres via lysmikroskopi for skader på cellerne. Medium udveksles derefter med en passende buffer og inkuberes inden eksperimentet. FITC-dextran-assayet anvendes under tarmpermeabilitetseksperimenter39 som en markør for monolagsintegritet. TEER-målinger foretages efter eksperimentet, og lysmikroskopi validerer resultaterne efter 24 timer. Forkortelser: TEER = transepitelial elektrisk modstand; ROCK = rho-associeret kinase; GSKiβ = glykogensyntasekinase beta; F = fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.
Protocol
Forskningen blev godkendt og udført i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee of Iowa State University (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017). I det følgende afsnit (trin 1.1-1.3) beskrives permeable support seeding protocol, og procedurerne er opsummeret i figur 3.
Figur 3: Arbejdsgang for den permeable support seeding protokol. De permeable støtteindsatser er forbelagt med en kombination af CMGF + R / G, kollagen I og den ekstracellulære membranmatrix og derefter inkuberet. Medier fra hundeorganoidkulturen aspireres og erstattes med en cellegenvindingsopløsning efterfulgt af en 30 minutters inkubation ved 4 °C. Kulturen overføres efterfølgende til et rør, og organoid dissociation udføres ved anvendelse af trypsinlignende protease. Ikke-associerede organoider fjernes ved passage gennem en sil for at opnå en enkeltcellesuspension, og cellekoncentrationen bestemmes ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller. Cellerne podes på en permeabel støtteindsats, og CMGF + R / G tilsættes til det basolaterale kammer. Kulturen inkuberes derefter i 24 timer, og den resterende væske fjernes fra det apikale kammer og erstattes med CMGF + R / G. Forkortelser: ROCK = rho-associeret kinase; GSKiβ = glykogensyntasekinase beta; CMGF + R / G = Komplet medium med vækstfaktorer forbedret med ROCK-hæmmer og GSKiβ. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Permeabel support seeding protokol
- Forbelægning af de permeable støtteindsatser
- Komplet medium med vækstfaktorer forstærket med Rho-associeret proteinkinase (ROCK) hæmmer og glykogensyntasekinase-betahæmmer (GSKiβ) (CMGF + R/G) i henhold til oplysningerne i tabel 1.
- Forbered en isspand og begynd at optø den ekstracellulære membranmatrix på is. Placer en 24-brøndplade indeholdende det nødvendige antal indsatser i inkubatoren for at forvarme. Saml rottehalekollagen I (3 mg / ml) og læg den på is, mens du beskytter mod lys. Saml CMGF + R / G og læg den på is.
- Beregn det samlede antal indsatser og emner, der kræves til eksperimentet, og hold 100 μL af belægningsopløsningen til side for hver indsats.
BEMÆRK: Forbered mere belægningsopløsning end nødvendigt; det anbefales at forberede mindst 15% mere end nødvendigt. - I et 15 ml rør blandes CMGF + R / G med den ekstracellulære membranmatrix (1%) og kollagen I (1%) og forsigtigt pipette blandes.
- Overtræk hver polyesterindsats med 100 μL af belægningsopløsningen, og læg indsatserne i inkubatoren (37 ° C; 5% CO2 -atmosfære) i 1 time.
- Efter inkubationen skal belægningsopløsningen forsigtigt opsuges af hvert indlæg ved hjælp af en vakuumspirator eller en P1000-pipette, idet du skal være forsigtig med ikke at forstyrre indsatsfilteret. Placer en forbelagt plade i inkubatoren for at holde varmen.
- Canine organoid dissociation
BEMÆRK: Brug hundeorganoider, der er blevet dyrket i mindst fire dage. Før du begynder dissociation, henvises til Gabriel et al.38 for at bestemme, hvornår en prøve er sund, tæt og tilstrækkelig til eksperimentering. Det anbefales at adskille en ekstra brønd af organoider til hver brøndbelægningsprocedure. Desuden anbefales det at øge det ønskede antal indsatser med ~ 20% for at tage højde for ujævn organoidvækst eller skade forårsaget af forkert manipulation. Hvis du planlægger at bruge FITC-dextran, skal du forberede ekstra brønde.- Forbered en isspand og et hætteglas med koldt 1x Advanced DMEM/F12-lager i biosikkerhedsskabet.
- Placer den ekstracellulære membranmatrix på is for at begynde optøning, nedsænk den i is for at beskytte mod hurtig optøning og undgå størkning. Anbring en kasse med pipettespidser (P200) i fryseren til plettering af den ekstracellulære membranmatrix.
- Prechill en kølecentrifuge til 4 °C.
- Flyt CMGF+ R/G fra fryseren/køleskabet til et 37 °C vandbad. Undgå direkte lyseksponering, når det er muligt.
- Fjern alt medium fra 24-brøndplade med organoidkultur for et passende antal brønde (1 brønd af en 24-brøndplade pr. 2-4 indsatser), mens du sørger for ikke at forstyrre den ekstracellulære membranmatrix.
BEMÆRK: Lydstyrken kan variere afhængigt af det anvendte celletællingssystem. - Der tilsættes 0,5 ml præchilled Cell Recovery Solution pr. brønd for at opløse de ekstracellulære membranmatrixkupler.
- Pladen inkuberes i køleskabet (4 °C) i 30 min.
- Pipette suspensionen, saml alle organoider og opløst ekstracellulær membranmatrix, og overfør dem til et 15 ml rør.
- Centrifuger (700 × g i 5 minutter ved 4 °C), og fjern supernatanten, indtil niveauet når 0,5 ml-mærket, og sørg for ikke at forstyrre pelleten.
- Tilsæt 1 ml trypsinlignende protease og inkuber i 37 °C vandbad i 8 min. Svirp røret flere gange i inkubationsperioden for at blande cellerne.
- Overfør røret med prøven tilbage til et biosikkerhedsskab, og tilsæt langsomt 7 ml prechilled Advanced DMEM / F12 for at inaktivere den trypsinlignende protease og stoppe celledissociation.
- Forindlæg en 40 μm cellesi med 1 ml Avanceret DMEM/F12. Forsigtigt pipetter blandingen og filtrer suspensionen igennem; pipettere yderligere Advanced DMEM/F12 for at skylle sien.
- Røret centrifugeres (700 × g i 5 minutter ved 4 °C), og supernatanten fjernes. Forstyr ikke pelleten.
- Resuspend cellepillen i ~ 50-100 μL kulturmedium (CMGF + R / G) for hver brønd af organoider, der blev disassocieret.
- Tæl en delprøve af suspensionen (~ 10 μL) ved hjælp af et hæmocytometer eller en passende maskine, og bestem det samlede celletal i suspensionen.
- Hunde organoid såning
- Cellesuspensionen fortyndes eller koncentreres for at opnå en cellekoncentration på ~75.000 celler pr. ml.
- Frø 100 μL af suspensionen i hvert indlæg ved hjælp af BSA (1%) forbelagte spidser for at undgå celleadhæsion under overførsel. Tilføj en belagt indsats som et cellefrit emne uden at nogen organoider vokser, mens du stadig modtager regelmæssige medieændringer.
- Hvirvl forsigtigt pladen i en cirkulær bevægelse i ~ 30 s for at sprede de podede celler over indsatsen. Bekræft via lysmikroskopi den jævne fordeling af celler.
- Der tilsættes 700 μL CMGF + R/G til det basolaterale kammer, og pladen anbringes i inkubatoren (37 °C; 5 % CO2 -atmosfære) i 24 timer.
- Efter 24 timer fjernes cellesuspensionen forsigtigt fra det apikale kammer og erstattes med 200 μL CMGF + R / G. Sæt pladen tilbage til inkubatoren.
2. Vedligeholdelsesprotokol for organoidcelle monolag
BEMÆRK: Følgende afsnit (trin 2.1-2.2) beskriver vedligeholdelsesprotokollen for organoidcellemonolag. Arbejdsgangen for procedurer, der præsenteres i denne protokol, er opsummeret i figur 4. En tabel til notetagning, der kan hjælpe med standardiseringen af TEER-værdimålinger, er vist i supplerende tabel 1.
Figur 4: Arbejdsgang for vedligeholdelse af den permeable supportkultur. TEER-værdier måles ved hjælp af elektroder (sonder) og en volt / ohm meter. Prober skal kemisk steriliseres med 70% alkohol inden indsættelse i brøndene. De tomme og organoide celleindsatser måles, og TEER-værdier beregnes. Medium opdateres efterfølgende i både apikale og basolaterale kamre, og hundeorganoidkulturen på indsatsen visualiseres ved hjælp af lysmikroskopi. Tårer i enten organoidkultur eller mikroporøs membran bemærkes og håndteres i henhold til protokollen. Forkortelse: TEER = transepitelial elektrisk modstand. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Måling af TEER-værdi
BEMÆRK: TEER-værdimålinger udføres ved hjælp af en Epitel Volt / Ohm Meter med spisepindfastgørelse. Se producentens brugsanvisning. TEER-værdier giver information om integriteten af hundeorganoid monolaget.- Tag TEER-værdimålinger på hver alternativ dag under cellekulturvækst.
- Flyt epitel volt/ohm måleren og dens elektroder til biosikkerhedsskabet. Steriliser elektroderne kemisk i 70% alkohol før brug. Indstil funktionen til Ohms. Vent mindst et minut, indtil elektroderne tørrer.
- Før du foretager den første måling, skal du indsætte ledningselektroden i porten og tænde for strømmen. Sørg for, at måleren viser 1.000 Ω med trådelektrodeindsatsen i stedet for målespisepinde. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du justere enheden.
- Indsæt elektroderne i det apikale og basolaterale kammer i den cellefrie indsats (blank), så det apikale kammer indeholder den kortere elektrode, og det basolaterale kammer indeholder den længere elektrode (som vist i figur 4). Rør ikke ved membranen, men sørg samtidig for, at elektroderne er nedsænket i mediet.
- Vent et par sekunder, indtil værdien stabiliseres, og noter værdien i en laboratoriebog. Mål de resterende hundeorganoid monolag, og sørg for at sterilisere elektroderne med 70% alkohol, når du måler forskellige prøver. Pas på ikke at røre organoid monolaget med elektroden.
- Efter målinger er foretaget, steriliseres elektroderne med 70% alkohol for sidste gang. Sørg for at beskytte dem mod skader forårsaget af upassende manipulation og opbevar dem i henhold til producentens anvisninger.
- Beregn TEER-værdierne for hver brønd ved hjælp af Eq (1), hvorR-prøven ogR-blank er ohm -værdierne (Ω) fra henholdsvis monolaget og blanke brønde, og arealet (cm²) er indsatsens.
(1)
- Vedligeholdelse af monolag
BEMÆRK: Gennemgå den anbefalede mellemændringsplan i tabel 2.- Brug sterile engangs 9 "Pasteur-pipetter og en vakuumaspirator til forsigtigt at aspirere mediet fra de apikale og derefter de basolaterale kamre. Vip pladen for at se den mellemstore overflade tydeligt. Undgå at aspirere for tæt på den mikroporøse membran i det apikale kammer for at forhindre beskadigelse af cellemonolaget.
BEMÆRK: Brug et nyt Pasteur-rør, når du flytter mellem prøver. Pipetter er også en mulig erstatning for denne procedure. - Tilsæt langsomt CMGF+ R/G ved hjælp af P1000-pipetter, der sigter mod en væg i det apikale eller basolaterale kammer. Udfør medieskiftet i det apikale kammer meget omhyggeligt for at undgå at beskadige monolaget.
- Kontroller brøndene hver anden dag under et lysmikroskop, vurder kulturens sundhed og overvågning for tårer i det organoide monolag eller den mikroporøse membran. Brug fasekontrastmikroskopi til at fremhæve detaljer om kulturen.
BEMÆRK: I tilfælde af hundeorganoid monolag tårer får monolaget tid til at komme sig og vokse igen. I tilfælde af mikroporøs membrantårer skal brønden udelukkes fra eksperimentet.
- Brug sterile engangs 9 "Pasteur-pipetter og en vakuumaspirator til forsigtigt at aspirere mediet fra de apikale og derefter de basolaterale kamre. Vip pladen for at se den mellemstore overflade tydeligt. Undgå at aspirere for tæt på den mikroporøse membran i det apikale kammer for at forhindre beskadigelse af cellemonolaget.
(1)Tabel 2: Anbefaling af medieændring for organoidkulturer. CMGF + R / G skiftes i brøndenes apikale og basolaterale kammer hver anden dag på hver alternativ dag. Den længere kulturperiode i weekenden kræver en øget mængde medium i både basolaterale og apikale kamre, som anvendes en fredag eftermiddag og ændres mandag. Forkortelser: ROCK = rho-associeret kinase; GSKiβ = glykogensyntasekinase beta; CMGF + R / G = Komplet medium med vækstfaktorer forbedret med ROCK-hæmmer og GSKiβ. Klik her for at downloade denne tabel.
3. Permeabilitet eksperimentel protokol
BEMÆRK: Følgende afsnit (trin 3.1-3.5) beskriver permeabilitetsforsøgsprotokollen. Den eksperimentelle protokolarbejdsgang til måling af et lægemiddels in vitro-permeabilitet er opsummeret i figur 5.
Figur 5: Arbejdsgang for forsøgsprotokollen. Organoidmedium skal ændres fra CMGF + R / G til CMGF + mellem otte og tolv dage efter såning af indsatserne, hvilket giver mulighed for cellulær differentiering. Efter at have ændret mediet (både apikalt og basolateralt) til CMGF +, bør TEER-værdierne stadig stige, idet hundeorganoid monolaget næsten når sammenløb. Mindst fire dage efter, at mediet er ændret til CMGF+, evalueres monolags beredskabet. Når monolaget er helt dannet, og TEER-værdierne når en plateaufase (typisk mellem 1.500 og 2.500 Ω.cm2), udveksles mediet med transportbufferen i 30 minutter, så monolaget kan tilpasse sig det nye miljø. På tidspunktet 0 min af eksperimentet udføres FITC-dextran-analysen, og den 20 min basolaterale prøve opsamles. Resultaterne analyseres efterfølgende på en pladelæser. Efter eksperimentet ændres det apikale og basolaterale kammerindhold igen til CMGF+, og TEER-værdiaflæsninger tages. Monolaget inkuberes i 24 timer, og monolagets integritet vurderes gennem gentagne TEER-målinger. Forkortelser: TEER = transepitelial elektrisk modstand; ROCK = rho-associeret kinase; GSKiβ = glykogensyntasekinase beta; CMGF + R / G = Komplet medium med vækstfaktorer forbedret med ROCK-hæmmer og GSKiβ; CMGF + = Komplet medium med vækstfaktorer, men uden ROCK-hæmmer eller GSKiβ; FITC = fluoresceinisothiocyanat; F = fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Evaluering af organoid monolags beredskab
BEMÆRK: Dette trin sker 8-14 dage efter såning.- Kontroller monolaget mindst hver anden dag under lysmikroskopet (brug fasekontrast til at visualisere monolagets integritet). Fortsæt til næste trin, når cellemonolaget er fuldt dannet uden huller eller tydelige tegn på tårer.
- Skift organoidmediet fra CMGF+ R/G til CMGF+ (undtagen ROCK-hæmmer og GSKiβ fra mediesammensætningen). Det anbefales at bytte mediet mindst fire dage før eksperimentet.
BEMÆRK: Dette trin giver mulighed for korrekt differentiering af organoid monolaget. - Fortsæt med at måle TEER-værdier ca. hver anden dag. Når TEER-værdierne begynder at ligge på ca. 1.500 til 2.000 Ω × cm² (figur 6), skal du måle TEER-værdierne hver dag.
BEMÆRK: Denne steady state kan opretholdes i ca. 2-3 dage, hvilket er det optimale tidsvindue til at udføre permeabilitetstest (normalt på dag 11 til 13). Plateau TEER-værdierne kan let svinge baseret på tarmlokaliseringen af organoiderne, måletemperatur, race, alder og sygdomstilstand hos hunden. - Planlæg lægemiddelpermeabilitetsassayet straks for at undgå et hurtigt fald i TEER-værdier eller overvækst af det organoide monolag til flere cellelag.
- Forberedelse til eksperimentet
BEMÆRK: Inkubatorrystere kan bruges under eksperimentet for at undgå virkningerne af det urørte vandlag. Mål TEER-værdier ved ensartede temperaturer.- På dagen for eksperimentet skal du måle TEER-værdier og bekræfte, at værdierne nåede en stabil tilstand og ikke falder hurtigt.
- Vælg de bedste monolag (via lysmikroskopi og TEER-værdier) blandt de overskydende 20% indsatser til at udføre eksperimentet.
- Overhold monolagene under et lysmikroskop og udelukker ufuldstændige, revne eller overgroede organoide monolag.
- Forbered transportbufferen, og juster dens pH til de ønskede værdier.
BEMÆRK: Sammensætningen af den eksperimentelle buffer varierer afhængigt af den eksperimentelle opsætning. En ofte anvendt buffer består af Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), glucose (12,5 mM) og 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsyre (HEPES, 25 mM). Denne sammensætning sikrer levedygtigheden af organoidkultur under et forsøg. - Opsuge forsigtigt mediet fra de apikale og basolaterale kamre i de udvalgte brønde.
- Der tilsættes 200 μL transportbuffer til det apikale kammer og 800 μL til det basolaterale kammer.
BEMÆRK: Transportbuffer skal først tilsættes til det apikale kammer og derefter til det basolaterale kammer for at undgå løsrivelse af monolaget fra den mikroporøs membran. - Anbring pladen i inkubatoren (37 °C; 5% CO2 atmosfære) i 30 minutter for at afbalancere.
BEMÆRK: Hundeorganoid monolag er nu klar til lægemiddelpermeabilitetseksperimentet.
- Typisk eksperimentel layout-IgY-koncentrationsløsning
BEMÆRK: Det eksperimentelle design og layout kan ændre sig afhængigt af forskningsspørgsmålet. Permeabiliteten af immunoglobulin Y (IgY) gennem et organoid monolag anvendes i protokollen som et eksempel og kan modificeres. Udtrykket donorkammer refererer til det kammer, hvor lægemidlet oprindeligt påføres, mens modtagerkammeret henviser til det kammer, der accepterer lægemidlet fra donorkammeret. Et typisk eksperiment indsamler prøver i modtagerkamrene over 2 timer (f.eks. 15, 30, 60, 90, 120 min).- Forbered IgY-opløsningen (lægemiddel eller opløst stof efter eget valg) ved at opløse den i transportbufferen til den ønskede endelige koncentration. Forbered mere lægemiddelopløsning end nødvendigt.
BEMÆRK: Lægemidler med lav vandig opløselighed kan først opløses i et organisk opløsningsmiddel (f.eks. Ethanol, DMSO), før de tilsættes til bufferen. Den endelige koncentration af opløsningsmidlet skal være mindre end 1% for ikke at beskadige cellemonolaget. - Fjern bufferen fra donorkammeret (enten apikalt eller basolateralt kammer) i hver brønd.
- Tilsæt IgY-opløsningen (lægemiddelopløsning) til alle donorkamrene. Brug den resterende opløsning som tid 0-donoropløsning til måling af den oprindelige lægemiddelkoncentration.
- På de krævede tidspunkter skal du fjerne 50 μL fra modtagerkammeret og placere det i et mærket rør. På det sidste tidspunkt fjernes en prøve fra donorkammeret. Ved forsøgets afslutning overføres donor- og modtageralkvoterne til en fryser på -20 °C.
BEMÆRK: Hvis der er behov for mange tidspunkter, kan udskiftning af buffer i modtagekammeret udføres, men skal tages i betragtning ved beregningen af den tilsyneladende permeabilitet. Koncentrationen i modtagerkammeret bør ikke nå mere end 10% af donorkammeret ved forsøgets afslutning for at opretholde synkeforholdene44.
- Forbered IgY-opløsningen (lægemiddel eller opløst stof efter eget valg) ved at opløse den i transportbufferen til den ønskede endelige koncentration. Forbered mere lægemiddelopløsning end nødvendigt.
- Organoid celle monolag kvalitetskontrol
BEMÆRK: FITC-dextran-opløsning kan bruges til at bekræfte monolagsintegritet under forsøget. FITC-dextran bruges som et eksempel på et monolags integritetsassay. Andre omfatter Lucifer gul, PEG-4000, radiomærket mannitol og inulin44.- På tidspunktet 0 min aspireres indholdet af det apikale kammer og erstattes med 250 μL FITC-dextran-opløsning (5 mg / ml, 4 kDa) i tre eksemplarer for hver eksperimentel gruppe.
BEMÆRK: Udsæt ikke FITC-dextran for lys. - Efter 20 minutter fjernes bufferen fra det basolaterale kammer.
- Måle fluorescensintensiteten af den basolaterale prøve ved hjælp af en fluorescenspladelæser (brug en kalibreringskurve; excitering indstillet til 485 nm og emissionsværdi ved 528 nm).
BEMÆRK:P-app af FITC kan også beregnes ved hjælp af den metode, der er beskrevet i diskussionen. - Når eksperimentet er afsluttet, skal du omhyggeligt aspirere overskydende buffer fra de apikale og basolaterale kamre.
- Der tilsættes 200 μL CMGF+ i det apikale kammer og 700 μL til det basolaterale kammer.
- Mål TEER-værdier i de enkelte brønde.
- Anbring pladen i inkubatoren (37 °C; 5% CO2 atmosfære) i 24 timer.
- Hvis det er relevant, måles TEER-værdier efter 24 timer for at vurdere mulig skade på monolaget under kvalitetskontroldelen af eksperimentet. Brug lysmikroskopi til at visualisere integriteten af hundeorganoid monolaget.
- På tidspunktet 0 min aspireres indholdet af det apikale kammer og erstattes med 250 μL FITC-dextran-opløsning (5 mg / ml, 4 kDa) i tre eksemplarer for hver eksperimentel gruppe.
- Fastgørelse af cellemonolag til downstream-analyse
- Forbered formalin-eddikesyre-alkoholopløsning (FAA, sammensætning i tabel 1).
- Fjern transportbufferen eller CMGF+ fra de apikale og basolaterale kamre ved hjælp af en P1000 pipet eller sterile engangs 9" Pasteur pipets og en vakuumaspirator.
- Fyld de apikale og basale kamre med FAA.
- Efter 24 timer aspireres FAA og erstattes med 70% ethanol.
- Pakk pladen med fleksibel laboratoriefilm for at forhindre fordampning og fortsæt med blokforberedelse.
Figur 6: TEER-værdier på tværs af eksperimentelle grupper. TEER-værdier blev målt i fem grupper af hundeorganoide monolag. Tre grupper var sammensat af hunde jejunale enteroider, og to grupper bestod af colonoider. Hver gruppe omfattede 12 til 22 replikater. TEER-værdierne for jejunale enteroidkulturer er vist fra dag 4 til dag 14, og kolonoidkulturer vises fra dag 4 til dag 12 (målinger sluttede, da organoidmonolaget nåede steady state-værdier, hvilket indikerer, at monolaget var klar til eksperimentel brug). Fejlbjælker udtrykker SEM af målingerne. Forkortelse: TEER = transepitelial elektrisk modstand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Representative Results
Standardprocedurer for dyrkning af hundeorganoider blev tidligere beskrevet33, og Canine Organoid Protocol er også blevet diskuteret detaljeret i dette særnummer38. Hunde intestinale organoider dyrket på permeable understøtninger blev fastgjort og paraffinindlejret for at undersøge monolagets mikroanatomi og cellepopulationerne. Paraffinindlejringsprocessen blev tidligere diskuteret af Gabriel et al.38. Rutinemæssig farvning (hæmatoxylin og eosin) er blevet udført, og Alcian Blue-farvningsteknikken blev brugt til at detektere bægerceller i hundeorganoidmonolaget (se figur 7).
Figur 7: Canine intestinal organoid monolag farvning. Hunde intestinale organoider af kolon oprindelse i den permeable støtte er blevet paraffin-indlejret og farvet med H&E og AB. Repræsentative billeder blev taget ved hjælp af lysmikroskopi ved 40x (A) og 60x (B) forstørrelse. H&E-farvning afslører et søjleformet epitelmonolag, og mikrovilli i den apikale del af cellerne kan observeres ved 60x forstørrelse. AB-farvning afslører yderligere tilstedeværelsen af bægerceller (mørkeblå) i hundens tarmorganoid monolag. Skalastænger = 20 μm (A), 50 μm (B). Forkortelser: H&E = hæmatoxylin og eosin; AB = Alcian Blå. Klik her for at se en større version af denne figur.
Organoidkulturen på den permeable støtte skal dyrkes i 10 til 14 dage for at være klar til et permeabilitetsforsøg. Lysmikroskopi anvendes sammen med TEER-værdimålinger for at bekræfte, om organoidkulturen er parat til permeabilitetstest af lægemiddelkandidater. Repræsentative lysmikroskopiske billeder af forskellige hundeorganoid monolag fra raske og syge dyr er vist i figur 8.
Figur 8: Hundeorganoid monolagsmikroskopi. Billeder af voksende monolag som set under lysmikroskopi. Organoid monolag afledt af raske donorer er repræsenteret af jejunal enteroid (10x; 40x) og colonoid (20x; 40x) kulturer. Organoide monolag af syge donorer er repræsenteret af duodenale (5x; 10x) og ileale (5x; 10x) enteroider afledt af en hundepatient diagnosticeret med PLE. Begge PLE-organoidkulturer er eksempler på ukorrekt celleisolering under såning af organoider, og disse kulturer kunne ikke anvendes til lægemiddelpermeabilitetsassays på grund af tilstedeværelsen af 3D-organoider. Eksempler på afvigelser fra korrekt monolagsdannelse, såsom monolags tårer (5x), skyldes uforsigtig manipulation af de biologiske prøver. Den langvarige kultur af organoider (10x; 20x) skyldes den lange vedligeholdelse af organoiderne på indsatsen, når organoiderne begynder at ligne deres oprindelige 3D-struktur. Til sammenligning præsenteres billeder af traditionelle 2D-cellelinjer på de permeable understøtninger, der almindeligvis anvendes til lægemiddelpermeabilitetsundersøgelser (MDCK-10x; 40x og Caco-2-10x; 20x). Forkortelser: PLE = proteintabende enteropati; MDCK = Madin-Darby hunde nyre. Skalastænger = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). Klik her for at se en større version af denne figur.
Organoide monolag blev også fikseret i 3% Paraformaldehyd-3% Glutaraldehyd i phosphatbufferet saltvand (PBS). Transmissionselektronmikroskopi (TEM) blev brugt til at karakterisere ultrastrukturen af organoidkulturen på de permeable understøtninger. Mikroanatomiske strukturer af mikrovilli og tætte kryds kan ses i figur 9.
Figur 9: TEM-billeder af sunde hunde intestinale organoid monolag. TEM blev brugt til at afsløre den cellulære mikroarkitektur af jejunal (A), ileal (B) og colonic (C) organoid monolag. Den mikroporøse membran i den permeable støtteindsats er markeret med en gul pil. Tilstedeværelsen af mikrovilli (blå pil) og tætte kryds (rød pil) er afgrænset i billederne. Forkortelse: TEM = Transmissionselektronmikroskopi. Skalastænger = 5 μm (A), 2 μm (B, C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Både TEER-målinger og lysmikroskopi skal udføres for at sikre, at systemet er klar til permeabilitetstest. Analysen er klar til brug, når TEER når en stabil tilstand, mens lysmikroskopi hjælper med at udelukke skader eller tilvækst af organoiderne. Et resumé af typiske TEER-målinger af fem grupper bestående af hunde jejunale enteroider og colonoider er vist i figur 6.
Tabel 1: Sammensætning af organoidmedier og FAA. Den komplette sammensætning af CMGF+, CMGF+ R/G og FAA er opsummeret i denne tabel. Forkortelser: ROCK = rho-associeret kinase; GSKiβ = glykogensyntasekinase beta; CMGF + R / G = Komplet medium med vækstfaktorer forbedret med ROCK-hæmmer og GSKiβ; CMGF + = Komplet medium med vækstfaktorer, men uden ROCK-hæmmer eller GSKiβ; FAA = formalin-eddikesyre-alkohol; EGF = epidermal vækstfaktor. Denne tabel er tilpasset fra 38. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 1: Tabel til notering af hundeorganoid det permeable støttesystem. Forkortelser: TEER = transepitelial elektrisk modstand; ROCK = rho-associeret kinase; GSKiβ = glykogensyntasekinase beta; CMGF + R / G = Komplet medium med vækstfaktorer forbedret med ROCK-hæmmer og GSKiβ; CMGF + = Komplet medium med vækstfaktorer, men uden ROCK-hæmmer eller GSKiβ. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Hunde intestinale organoidkulturer i det permeable støtteapparat er et unikt koncept, der forbinder traditionelle lægemiddelpermeabilitetsassays40 med en ny in vitro hundemodel 41. Forskellige typer hunde intestinale organoider kan anvendes og evalueres ud fra eksperimentets mål med minimale justeringer. Det anbefales at teste flere koncentrationer af lægemidlet af interesse i 3-4 brønde pr. Gruppe. Koncentrationerne kan baseres på den forventede tarmkoncentration af lægemidlet. Desuden kan brug af tidligere forskning hjælpe med at bestemme passende tidspunkter for undersøgelsesdesignet. Der bør foretages passende dokumentation af forsøgsdesign for at øge replikabiliteten og hjælpe med fejlfinding.
Denne teknologi har flere begrænsninger på grund af nyheden af metoden42, hovedsagelig på grund af manglen på standardisering i eksperimentelt design og udførelse af protokollen på tværs af laboratorier. Denne mangel på standardisering er blevet anerkendt af andre grupper43, og Canine 3D Organoid Monolayer Protocols vil føre til interlaboratorisk reproducerbarhed og indføre standardisering til dette system. Standardiserede tilgange til dataanalyse forbedrer replikabiliteten og kan styrke resultaterne af indledende lægemiddeltest ved hjælp af hundeorganoiderne i det permeable understøtningssystem på tværs af forskellige laboratorier. Hunde 3D-organoidmodellen mangler også datasæt, der sammenligner in vitro P-appværdier af modellægemidler med deres kendte humane eller hunde in vivo intestinale absorption, ligesom Caco-2-celler 44,45,46. Når sådanne data er genereret, kan denne hundeorganoidmodel anvendes til at vurdere tarmpermeabilitet under lægemiddeludvikling.
Det er afgørende, at der udvises omhu ved såning af organoiderne på det permeable støttesystem for at frø en høj nok tæthed af passende dissocierede celler. Systemets TEER-værdier er mere pålidelige og reproducerbare, når de dyrkes i strenge monolag. Langvarig dyrkning af monolag kan føre til en eksponentiel stigning i TEER-værdier, der når længere væk fra tarmens fysiologiske værdier. H&E-sektioner af sådanne 3D-strukturer viser derefter flere lag af celler over hinanden med ændrede strukturer af enterocytter tættere på membranen.
Efter en vellykket udvidelse af hundeorganoid monolaget kan resultaterne analyseres på samme måde som traditionelle 2D-celleassays ved at beregne et lægemiddels tilsyneladende permeabilitetskoefficient (Papp) formel44. P-appværdien (se Eq (2)) beskriver transporthastigheden på tværs af det cellulære monolag47.
(2)
Det 
er den indledende hældning af koncentrationen versus tidskurven (f.eks. nmol / s). A er arealet af indsatsen (cm2), og C0 er den oprindelige koncentration af lægemidlet eller forbindelsen i donorkammeret37. Pålidelig genkendelse af monolagsintegritet er en afgørende del af permeabilitetsassayet, der kræver standardisering. Lysmikroskopi og TEER-målinger anbefales til at vurdere hundeorganoider i et permeabelt støttesystem og hjælpe med at bestemme den korrekte timing af eksperimentet. Derudover kan nul molekylære permeabilitetsmarkører (f.eks. FITC-dextran, Lucifer gul, PEG-400) bruges til funktionelt at evaluere organoid monolags integritet. Vær opmærksom, hvis den testede forbindelse påvirkes af en transportør. P-glycoprotein (P-gp) bruges som et almindeligt effluxpumpeeksempel. Der skal genereres et efflux-forhold (P-app, BL-AP /P-app, AP-BL) sammenlignet med et velkendt P-gp-sondesubstrat.
Lysmikroskopi (almindelig eller forbedret med fasekontrast) er en uvurderlig metode til at kontrollere integriteten af 2D- eller 3D-monolaget og filterindsatsen, mens man vurderer mulig cellulær tilvækst. Figur 7 kan tjene som en guide til at genkende sunde hunde intestinale organoidcellekulturer. TEER-værdier er et vigtigt mål for dannelsen af intercellulære kryds og differentiering af organoidkulturerne i et intakt tarmepitel. Hundens tarmorganoider differentierer sig i enterocytter og bægerceller (figur 6). Disse slimproducerende celler giver mulighed for undersøgelse af lægemiddel-slim-interaktioner, hvilket har været vanskeligt at opnå ved hjælp af traditionelle 2D-cellekulturer48. Tilstedeværelsen af enteroendokrine celler er tidligere blevet bekræftet i hunde intestinale organoider af Chandra et al.33.
Yderligere karakterisering af hundeorganoid monolag afledt af jejunale, ileale og coloniske organoider ved anvendelse af TEM tilvejebringes. TEM-billeder viser cellulær mikroarkitektur, herunder tætte kryds og mikrovillidannelse, hvilket yderligere illustrerer kompleksiteten og anvendeligheden af disse organoidmodeller i translationel medicin. Baseret på de eksperimentelle resultater var organoidkulturerne på den permeable støtte klar til forsøg mellem dag 11 og dag 13 efter såning (figur 9). TEER-værdierne på dette tidspunkt varierede mellem 1.500 og 2.500 Ω.cm2. Plateaufasen af TEER-værdier varer i et meget begrænset tidsrum, hvor eksperimentet skal startes, før TEER-værdierne begynder at falde langsomt. TEER-værdier kan også være en afgørende del af visningen af vigtige eksperimentelle resultater, da nogle lægemidler eller lægemiddelprodukthjælpestoffer kan interagere med monolaget (f.eks. Tætte kryds), hvilket i høj grad kan påvirke TEER-værdiudlæsninger. Dette alene kan tjene som data for et eksperiment.
Hunde intestinale organoider i et dobbeltkammercellekulturapparat kan anvendes på andre områder end oral lægemiddelpermeabilitet på grund af den unikke arkitektur af det resulterende cellemonolag. For eksempel kan de bruges i mikrobiologisk forskning (f.eks. virkningen af at ændre GI mikrobiel flora), viral optagelsesundersøgelser, lægemiddelinteraktioner og lægemiddeltransportmekanismer49. Donorkammeret er typisk fyldt med det valgte testlægemiddel eller forbindelse, og aliquoter fra modtagerkammeret tages på forskellige tidspunkter. Disse aliquoter kan analyseres ved hjælp af højtydende væskekromatografi, massespektrometri, enzymbundet immunosorbentassay eller andre teknikker til bestemmelse af mængden og hastigheden, hvormed det opløste stof gennemsyrer gennem monolaget.
Disse undersøgelser kræver et intakt monolag for at vurdere lægemiddelpermeabilitet nøjagtigt. Dette kræver typisk dyrkning af monolag ud over dem, der er nødvendige for at tage højde for ubrugelige brønde. Organoidcellemonolag kan også bruges til at måle viral optagelse enten fra den apikale eller basale side af et monolag med aflæsninger inklusive immunofluorescensassays- ved hjælp af antistoffer til at detektere virusets cellulære optagelse. Endelig kan flere lægemidler (dvs. substrat og inhibitor) påføres donorkammeret for at identificere transportørbaserede lægemiddelinteraktioner.
Baseret på de nuværende observationer vil disse metoder ikke kun kunne anvendes på hundeorganoider i kulturindsatser, men vil også være egnede til andre veterinære arter og organsystemer med mindre ændringer, der er nødvendige for bedst at passe til den valgte art eller organmodel. Protokoller for hunde intestinal organoidvækst måtte justeres baseret på kulturens unikke egenskaber. Protokollen kan således justeres til en anden art, men vil kræve subtile ændringer i protokollen. Modifikationer kan begynde med ændringer i cellesåningstæthed og udvides til ændringer i mediesammensætningen for korrekt at differentiere organoiderne af interesse.
Standardisering, detaljeret dokumentation af eksperimentelle procedurer og konsekvent overvågning af cellemonolaget er afgørende praksis, der er nødvendig på tværs af de permeable supportassays og er ikke begrænset til hundesystemet. Disse mulige arter eller organændringer er afgørende for at dokumentere og rapportere for yderligere fremskridt på området. Denne model har flere begrænsninger, for eksempel dens omkostningskrav, interlaboratorisk variabilitet og begrænsede data om evnen til at forudsige intestinal absorption in vivo. Hunde har i nogle tilfælde forskellige lægemiddeltransportører og metaboliserende enzymer end mennesker50.
Endvidere skal hundeorganoidsystemet testes på en række andre dobbeltkammerapparater fra andre producenter for at bestemme egnetheden af en sådan model (f.eks. skal egnetheden af forskellige filtermembransammensætninger bestemmes). En anden ulempe er, at lægemiddelpermeabilitetseksperimentdelen af manuskriptet er mindre beskrivende end de foregående dele. Dette skyldes et overskud af information på dette område. Målet med denne del af manuskriptet var at beskrive disse metoder på en modificerbar måde uden at skære kanterne af hjørnestenene i disse eksperimenter. Mere detaljerede oplysninger om permeabilitetsforsøg er indsamlet af Hubatsch et al.37. Derudover kan permeable indsatser bruges i coculture, cellemigration og invasionsassayeksperimenter4.
Afslutningsvis har hundens tarmorganoider i dobbeltkammerkulturapparater potentialet til at blive brugt i en lang række applikationer, herunder biomedicinske felter og translationel medicin, for at nævne nogle få. Protokollerne skaber flere strategier til at planlægge et eksperiment og fremme interlaboratorisk data pålidelighed for organoidmodeller på tværs af biologiområdet.
Disclosures
K. Allenspach er medstifter af LifEngine Animal Health og 3D Health Solutions. Hun fungerer som konsulent for Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics og Mars. J.P. Mochel er medstifter af LifEngine Animal Health og 3D Health Solutions og fungerer som konsulent for Ceva Animal Health and Ethos Animal Health. Denne artikel afspejler forfatternes synspunkter og bør ikke fortolkes som en repræsentation af Food and Drug Administration's godkendelse, synspunkt eller politikker. Andre forfattere har ingen interessekonflikt at erklære.
Acknowledgments
Vi vil gerne udtrykke taknemmelighed til Veterinary Diagnostic Laboratory of Iowa State University medarbejdere, nemlig Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green og Jennifer Groeltz-Thrush, for rettidig behandling af prøver. Vi vil også gerne takke Jodi Smith og Bethann Valentine for at levere materiale til permeabilitetseksperimenterne. Vi vil også gerne takke David Diaz-Reganon for hans hjælp med figur 9. Bortset fra figur 6 blev alle tal oprettet i BioRender.com. Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra fakultetets opstart, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award og NSF SBIR subaward til ISU # 1912948.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid media | |||
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| TMS (trimethoprim sulfate) | Sigma | T7883-5G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous | Acros Organics | 170080010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
| FITC-CM-Dextran | Millipore Sigma | 68059-1G | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14025-076 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Materials and Equipment | |||
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 9" Pasteur Pipets | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning | 3470 | Permeable Support |
| Millicell ERS (Probes) | Millipore Sigma | MERSSTX01 | |
| Millicell ERS-2 Voltohmmeter | Millipore Sigma | MERS00002 | |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Flexible Laboratory Film |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
References
- Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments JoVE. (80), e50638 (2013).
- Youhanna, S., Lauschke, V. M. The Past, present and future of intestinal in vitro cell systems for drug absorption studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (1), 50-65 (2021).
- Belic, S., et al. Comparative analysis of inflammatory cytokine release and alveolar epithelial barrier invasion in a transwell®bilayer model of mucormycosis. Frontiers in Microbiology. 3204, 3204 (2019).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51046 (2014).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411 (2019).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- Natoli, M., Leoni, B. D., D’Agnano, I., Zucco, F., Felsani, A. Good Caco-2 cell culture practices. Toxicology in Vitro. 26 (8), 1243-1246 (2012).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Chandler, M., et al. Obesity and associated comorbidities in people and companion animals: a One Health perspective. Journal of Comparative Pathology. 156 (4), 296-309 (2017).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
- Galeta, P., Lázničková-Galetová, M., Sablin, M., Germonpré, M. Morphological evidence for early dog domestication in the European Pleistocene: New evidence from a randomization approach to group differences. Anatomical Record. 304 (1), 42-62 (2021).
- Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nature Reviews Endocrinology. 14 (3), 140-162 (2018).
- Allenspach, K., Wieland, B., Gröne, A., Gaschen, F. Chronic enteropathies in dogs: Evaluation of risk factors for negative outcome. Journal of Veterinary Internal Medicine. 21 (4), 700-708 (2007).
- Wang, J., et al. Proliferative and invasive colorectal tumors in pet dogs provide unique insights into human colorectal cancer. Cancers. 10 (9), 330 (2018).
- Gillespie, V., Baer, K., Farrelly, J., Craft, D., Luong, R. Canine gastrointestinal stromal tumors: Immunohistochemical expression of CD34 and examination of prognostic indicators including proliferation markers Ki67 and AgNOR. Veterinary Pathology. 48 (1), 283-291 (2011).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
- Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: the One Health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
- Artursson, P., Palm, K., Luthman, K. Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 22 (1-2), 67-84 (1996).
- Balimane, P. V., Han, Y. H., Chong, S. Current industrial practices of assessing permeability and P-glycoprotein interaction. AAPS Journal. 8 (1), 1-13 (2006).
- Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Calcagno, A. M., Ludwig, J. A., Fostel, J. M., Gottesman, M. M., Ambudkar, S. V. Comparison of drug transporter levels in normal colon, colon cancer, and caco-2 cells: Impact on drug disposition and discovery. Molecular Pharmaceutics. 3 (1), 87-93 (2006).
- Hilgendorf, C., et al. Expression of thirty-six drug transporter genes in human intestine, liver, kidney, and organotypic cell lines. Drug Metabolism and Disposition. 35 (8), 1333 (2007).
- Seithel, A., Karlsson, J., Hilgendorf, C., Björquist, A., Ungell, A. L. Variability in mRNA expression of ABC- and SLC-transporters in human intestinal cells: Comparison between human segments and Caco-2 cells. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (4), 291-299 (2006).
- Volpe, D. A. Transporter assays as useful in vitro tools in drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 11 (1), 91-103 (2016).
- Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS ONE. 16 (10), 257824 (2021).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Thummel, K. E., et al. Transcriptional control of intestinal cytochrome P-4503A by 1α,25-dihydroxy vitamin D3. Molecular Pharmacology. 60 (6), 1399-1406 (2001).
- Kodama, N., et al. Characteristic analysis of intestinal transport in enterocyte-like cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. Drug Metabolism and Disposition. 44 (10), 1662-1667 (2016).
- Akazawa, T., et al. Application of intestinal epithelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells for studies of prodrug hydrolysis and drug absorption in the small intestine. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 46 (11), 1497-1506 (2018).
- Lo, B., Parham, L. Ethical issues in stem cell research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
- Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
- Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (179), e63515 (2022).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
- van Breemen, R. B., Li, Y. Caco-2 cell permeability assays to measure drug absorption. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 1 (2), 175-185 (2005).
- Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Olivatti, T. O. F., Alcantara, G. P., Lemos, A. C. C. E., Silva, M. G., Miot, H. A. Standardization of organoid culture for evaluation of melanogenesis induced by UVB, UVA and visible light. Anais Brasileiros de Dermatologia. 95 (1), 46-51 (2020).
- Volpe, D. A., et al. Classification of drug permeability with a Caco-2 cell monolayer assay. Clinical Research and Regulatory Affairs. 24 (1), 39-47 (2007).
- Chen, C., Ma, M. G., Fullenwider, C. L., Chen, W. G., Sadeque, A. J. M. Biopharmaceutics permeability classification of lorcaserin, a selective 5-hydroxytryptamine 2C agonist: Method suitability and permeability class membership. Molecular Pharmaceutics. 10 (12), 4739-4745 (2013).
- Jarc, T., et al. Demonstrating suitability of the Caco-2 cell model for BCS-based biowaiver according to the recent FDA and ICH harmonised guidelines. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (8), 1231-1242 (2019).
- Newby, D., Freitas, A. A., Ghafourian, T. Decision trees to characterise the roles of permeability and solubility on the prediction of oral absorption. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 751-765 (2015).
- Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS ONE. 8 (7), 68761 (2013).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Martinez, M. N., Mochel, J. P., Neuhoff, S., Pade, D. Comparison of canine and human physiological factors: understanding interspecies differences that impact drug pharmacokinetics. The AAPS Journal. 23 (3), 59 (2021).
