Гетеротопная модель мыши для изучения трансплантации гортани
Summary
Целью этой рукописи является описание микрохирургических этапов, необходимых для выполнения гетеротопной трансплантации гортани у мышей. Преимуществами этой мышиной модели по сравнению с другими животными моделями трансплантации гортани являются ее экономическая эффективность и доступность иммунологических анализов и данных.
Abstract
Гетеротопная трансплантация гортани, хотя и является технически сложной процедурой, предлагает больше научного анализа и экономических преимуществ по сравнению с другими моделями животных. Хотя эта техника впервые описана Шипчандлером и др. в 2009 году, она не получила широкого распространения, возможно, из-за трудностей в изучении микрохирургической техники и времени, необходимого для ее освоения. В этой статье подробно описываются хирургические этапы, а также потенциальные подводные камни, которых следует избегать, чтобы стимулировать эффективное использование этой техники.
В этой модели двусторонние сонные артерии донорской гортани анастомозируются к сонной артерии реципиента и наружной яремной вене, что позволяет кровотоку через трансплантат. Кровоток может быть подтвержден интраоперационно визуализацией наполнения крови в двусторонних сонных артериях трансплантата, покраснением щитовидной железы трансплантата и кровотечением из микрососудов в трансплантате. Важнейшими элементами успеха являются деликатное сохранение сосудов трансплантата, проведение артериотомии и венотомии правильного размера, а также использование соответствующего количества швов на артериально-артериальных и артериально-венозных анастомозах для обеспечения безопасности сосудов без утечки и предотвращения окклюзии.
Любой желающий может овладеть этой моделью с достаточной подготовкой и выполнить процедуру примерно за 3 часа. В случае успешного выполнения эта модель позволяет проводить иммунологические исследования с легкостью и по низкой цене.
Introduction
Для пациентов, страдающих непоправимым повреждением гортани или раком гортани, тотальная ларингэктомия часто является единственным вариантом1. Тотальная ларингэктомия оставляет пациентов без возможности дышать и говорить самостоятельно, в дополнение к переживанию социального и психологического стресса2. Пациенты с раком гортани, которые нуждаются в тотальной ларингэктомии, являются отличными потенциальными кандидатами на трансплантацию гортани. В то время как трансплантация гортани человека в условиях непоправимого повреждения гортани была выполнена, аллотрансплантация гортани в настоящее время избегается у этих пациентов из-за страха рецидива опухоли, возможности хронического отторжения и инфекций донорского происхождения3. Иммуносупрессия является основной причиной этих проблем. Резкая потеря первого пациента с частичной трансплантацией гортани из-за рецидива опухоли после обычного иммуносупрессивного лечения является свидетельством того, что соответствующий иммуносупрессивный режим должен быть разработан до дальнейших попыток трансплантации у пациентов с раком гортани 4,5.
Чтобы лучше понять иммунный ответ хозяина на пересаженную гортань, первая модель трансплантации гортани у крыс была разработана в 1992 году Стромом, а улучшения в хирургической технике были сделаны в 2002 году 6,7. Хотя эта модель эффективна для изучения трансплантации гортани, отсутствие специфических для крыс иммунологических агентов и более высокая стоимость, связанная с моделями крыс, привели к разработке новой мышиной модели для изучения трансплантации гортани в 2009году8.
Основным применением описанной методики является изучение различных схем иммуносупрессивных препаратов при трансплантации гортани. Улучшение современных иммуносупрессивных методов лечения может расширить пул кандидатов и привести к безопасной трансплантации у больных раком. Преимуществами этой мышиной модели являются ее экономическая эффективность и широкая доступность иммунологических данных и реагентов.
Команды, работающие над иммуносупрессивными схемами лечения трансплантации гортани, могут использовать этот метод для сбора большого объема иммунологических данных, а различные схемы лечения могут быть быстро протестированы и сопоставлены. Другие потенциальные методы лечения, которые могут модулировать иммунный ответ на трансплантацию, такие как инъекции стволовых клеток, также могут быть протестированы с использованием этой модели. Наконец, эксперименты могут быть разработаны для наблюдения долгосрочных системных эффектов трансплантации гортани путем продления периода наблюдения.
Метод, описанный здесь, использует сквозные анастомозы для обеспечения артериального и венозного потока к гетеротопному трансплантату гортани. Трансплантат представляет собой ларинготрахеэзофагеальный (LTE) комплекс, включающий гортань, щитовидную железу, паращитовидные железы, трахею и пищевод донора, с двусторонними сонными артериями и нетронутыми ножками. Одна донорская сонная артерия анастомозируется к сонной артерии реципиента и обеспечивает артериальный кровоток, в то время как другая донорская сонная артерия анастомозируется к наружной яремной вене реципиента и обеспечивает венозный кровоток (рисунок 1).
Несколько модификаций были внесены в хирургическую технику модели крысы, чтобы обеспечить успех в мышиной модели. Например, вместо инъекционного агента использовался ингаляционный анестетик для повышения контроля над глубиной анестезии и уменьшения осложнений. Непрерывное наложение швов применяется при артериально-артериальном анастомозе у крыс; однако из-за меньшего размера сосудов мышей это технически сложно и может вызвать сужение просвета сосуда7. В результате прерывистые швы используются в мышиной модели и приводят к улучшению проходимости сосудов. Кроме того, в модели крысы верхняя ножка щитовидной артерии (STA) рассечена и визуализирована. Учитывая меньший размер STA у мышей, это рассечение может привести к повреждению и даже трансекции STA. В результате он не препарируется в мышиной модели. Вместо этого близлежащая фасция сохраняется, чтобы гарантировать, что STA остается нетронутым.
Основные потенциальные подводные камни этого метода включают повреждение донорских ножек комплекса LTE, проведение артериотомии или венотомии неправильного размера, окклюзию сосудов в местах анастомоза или оставление пробелов в местах анастомоза, которые могут вызвать кровотечение. Чтобы избежать этих ошибок, необходимо соблюдать осторожность при приобретении донорского трансплантата, оставляя манжету ткани вокруг ножки STA. Артериотомия и венотомия должны быть достаточно большими, чтобы обеспечить кровоток, но достаточно маленькими, чтобы предотвратить утечку. Для анастомозов должно быть использовано соответствующее количество швов, чтобы закрыть любые промежутки, но не слишком много, чтобы закрыть сосуды.
Если получено знакомство с микрохирургическими методиками, эту процедуру можно выполнить примерно через 3 ч. Эта модель трансплантации гортани может быть надежно выполнена на мышах и использована для изучения иммунного ответа хозяина после васкуляризированной композитной аллотрансплантации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Заболеваемость и распространенность рака гортани увеличились на 12% и 24% соответственно за последние три десятилетия, и многие из этих пациентов проходят ларингэктомию для лечения10. Эта процедура значительно ухудшает качество жизни человека, а потому желательно альтернат?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Рэндалла Райша за его отличную видеографию и помощь в редактировании.
Materials
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
References
- Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1676-1679 (2001).
- Hilgers, F. J. M., Ackerstaff, A. H., Aaronson, N. K., Schouwenburg, P. F., Zandwijk, N. Physical and psychosocial consequences of total laryngectomy. Clinical Otolaryngology. 15 (5), 421-425 (1990).
- Heyes, R., Iarocci, A., Tchoukalova, Y., Lott, D. G. Immunomodulatory role of mesenchymal stem cell therapy in vascularized composite allotransplantation. Journal of Transplantation. 2016, (2016).
- Kluyskens, P., Ringoir, S. Follow-up of a human larynx transplantation. Laryngoscope. 80 (8), 1244-1250 (1970).
- Krishnan, G., et al. The current status of human laryngeal transplantation in 2017: A state of the field review. Laryngoscope. 127 (8), 1861-1868 (2017).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), 950-953 (1992).
- Lorenz, R. R., Dan, O., Nelson, M., Fritz, M. A., Strome, M. Rat laryngeal transplant model: technical advancements and a redefined rejection grading system. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 111 (12), 1120-1127 (2002).
- Shipchandler, T. Z., et al. New mouse model for studying laryngeal transplantation. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 118 (6), 465-468 (2009).
- Strome, M., Wu, J., Strome, S., Brodsky, G. A comparison of preservation techniques in a vascularized rat laryngeal transplant model. The Laryngoscope. 104 (6), 666-668 (1994).
- Nocini, R., Molteni, G., Mattiuzzi, C., Lippi, G. Updates on larynx cancer epidemiology. Chinese Journal of Cancer Research. 32 (1), 18-25 (2020).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), (1992).
- Work, W. P., Boles, R. Larynx: Replantation in the dog. Archives of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 82 (4), 401-402 (1965).
- Birchall, M. A., et al. Model for experimental revascularized laryngeal allotransplantation. British Journal of Surgery. 89 (11), 1470-1475 (2002).
- Nakai, K., et al. Rat model of laryngeal transplantation with normal circulation maintained by combination with the tongue. Microsurgery. 23 (2), 135-140 (2003).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Long-term laryngeal allograft survival using low-dose everolimus. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 142 (1), 72-78 (2010).
- Lott, D. G., Russell, J. O., Khariwala, S. S., Dan, O., Strome, M. Ten-month laryngeal allograft survival with use of pulsed everolimus and anti-αβ T-cell receptor antibody immunosuppression. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 120 (2), 131-136 (2011).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Decoy NF-κB fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells. The Laryngoscope. 120 (1), 44-52 (2010).
