Um modelo heterotópico de camundongo para estudar o transplante laríngeo
Summary
O objetivo deste manuscrito é descrever as etapas microcirúrgicas necessárias para a realização de um transplante laríngeo heterotópico em camundongos. As vantagens deste modelo de camundongo em comparação com outros modelos animais de transplante laríngeo são seu custo-efetividade e a disponibilidade de ensaios e dados imunológicos.
Abstract
O transplante heterotópico laríngeo, embora seja um procedimento tecnicamente desafiador, oferece mais análises científicas e benefícios de custo em comparação com outros modelos animais. Embora descrita pela primeira vez por Shipchandler et al. em 2009, essa técnica não é amplamente utilizada, possivelmente devido às dificuldades em aprender a técnica microcirúrgica e ao tempo necessário para dominá-la. Este artigo descreve detalhadamente as etapas cirúrgicas, bem como possíveis armadilhas a serem evitadas, a fim de incentivar o uso efetivo dessa técnica.
Neste modelo, as artérias carótidas bilaterais da laringe doadora são anastomosadas à artéria carótida receptora e à veia jugular externa, permitindo o fluxo sanguíneo através do enxerto. O fluxo sanguíneo pode ser confirmado no intraoperatório pela visualização do enchimento sanguíneo nas artérias carótidas bilaterais do enxerto, vermelhidão das glândulas tireoidianas do enxerto e sangramento dos microvasos do enxerto. Os elementos cruciais para o sucesso incluem a preservação delicada dos vasos do enxerto, a realização do tamanho correto da arteriotomia e venotomia e o uso do número adequado de suturas nas anastomoses arterial-arterial e arterial-venosa para fixar os vasos sem vazamento e prevenir a oclusão.
Qualquer pessoa pode se tornar proficiente nesse modelo com treinamento suficiente e realizar o procedimento em aproximadamente 3 h. Se realizado com sucesso, esse modelo permite que os estudos imunológicos sejam realizados com facilidade e baixo custo.
Introduction
Para pacientes que sofrem de dano laríngeo irreparável ou câncer de laringe, a laringectomia total é muitas vezes a única opção1. A laringectomia total deixa o paciente sem a capacidade de respirar e falar por conta própria, além de vivenciar sofrimento social e psicológico2. Pacientes com câncer de laringe que necessitam de laringectomia total são excelentes potenciais candidatos para o transplante laríngeo. Embora o transplante laríngeo humano no contexto de dano laríngeo irreparável tenha sido realizado, o alotransplante da laringe é atualmente evitado nesses pacientes devido ao medo de recorrência tumoral, à possibilidade de rejeição crônica e às infecções derivadas de doadores3. A imunossupressão é a principal causa dessas preocupações. A dramática perda do primeiro paciente transplantado laríngeo parcial devido à recidiva tumoral após o tratamento imunossupressor convencional é evidência de que um regime imunossupressor apropriado deve ser planejado antes que novas tentativas sejam feitas para transplante em pacientes com câncer de laringe 4,5.
Para melhor compreensão da resposta imune do hospedeiro a uma laringe transplantada, o primeiro modelo de transplante laríngeo em ratos foi desenvolvido em 1992 por Strome, e melhorias na técnica cirúrgica foram realizadas em 2002 6,7. Embora esse modelo seja eficaz para o estudo do transplante laríngeo, a falta de agentes imunológicos específicos para ratos e o maior custo associado aos modelos de ratos levaram ao desenvolvimento de um novo modelo de camundongo para o estudo do transplante laríngeo em 20098.
A principal aplicação da técnica descrita é estudar diferentes regimes de drogas imunossupressoras no transplante laríngeo. Melhorar as terapias imunossupressoras atuais pode ampliar o pool de candidatos e levar a um transplante seguro em pacientes com câncer. Os benefícios deste modelo de rato são a sua relação custo-eficácia e a ampla disponibilidade de dados imunológicos e reagentes.
Equipes que trabalham em regimes de tratamento imunossupressor para transplante laríngeo podem usar esse método para coletar um grande volume de dados imunológicos, e diferentes regimes de drogas podem ser rapidamente testados e comparados. Outras modalidades de tratamento potenciais que podem modular a resposta imune ao transplante, como injeções de células-tronco, também podem ser testadas usando esse modelo. Finalmente, experimentos podem ser desenvolvidos para observar os efeitos sistêmicos a longo prazo do transplante laríngeo, estendendo o período de acompanhamento.
A técnica aqui descrita utiliza anastomoses extremo-a-lado para fornecer fluxo arterial e venoso a um enxerto de laringe heterotópico. O enxerto é um complexo laringotraqueoesofágico (LTE) que compreende a laringe, as glândulas tireoides, as glândulas paratireoides, a traqueia e o esôfago do doador, com artérias carótidas bilaterais e pedículos intactos. Uma artéria carótida doadora é anastomosada à artéria carótida receptora e fornece fluxo sanguíneo arterial, enquanto a outra artéria carótida doadora é anastomosada à veia jugular externa receptora e fornece fluxo sanguíneo venoso (Figura 1).
Várias modificações foram feitas na técnica cirúrgica do modelo de rato para garantir o sucesso no modelo de camundongo. Por exemplo, um agente anestésico inalado foi usado em vez de um agente injetável para aumentar o controle sobre a profundidade da anestesia e reduzir as complicações. A sutura contínua é utilizada na anastomose artério-arterial em ratos; no entanto, devido ao menor tamanho dos vasos do rato, isso é tecnicamente difícil e pode causar estreitamento do lúmen do vaso7. Como resultado, suturas interrompidas são usadas no modelo de camundongo e resultam em melhor patência do vaso. Além disso, no modelo de rato, o pedículo da artéria tireoidiana superior (IST) é dissecado e visualizado. Dado o menor tamanho do STA em camundongos, essa dissecção pode resultar em danos e até mesmo transecção do STA. Como resultado, ele não é dissecado no modelo do mouse. Em vez disso, a fáscia próxima é preservada para garantir que o STA seja mantido intacto.
As principais armadilhas potenciais desta técnica incluem danificar os pedículos do complexo LTE do doador, fazer uma arteriotomia ou venotomia de tamanho incorreto, oclusão de vasos nos locais de anastomose ou deixar lacunas nos locais de anastomose que podem causar sangramento. Para evitar esses erros, deve-se tomar cuidado ao adquirir o enxerto doador, deixando um manguito de tecido ao redor do pedículo do STA. A arteriotomia e a venotomia devem ser grandes o suficiente para permitir o fluxo sanguíneo, mas pequenas o suficiente para evitar vazamentos. Um número apropriado de suturas deve ser usado para que as anastomoses fechem quaisquer lacunas, mas não muitas para ocluir os vasos.
Se a familiaridade com as técnicas microcirúrgicas for obtida, este procedimento pode ser realizado em aproximadamente 3 h. Este modelo de transplante laríngeo pode ser realizado de forma confiável em camundongos e usado para estudar a resposta imune do hospedeiro após alotransplante composto vascularizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
A incidência e a prevalência de câncer de laringe aumentaram 12% e 24%, respectivamente, nas últimas três décadas, e muitos desses pacientes foram submetidos à laringectomia para tratamento10. Este procedimento piora significativamente a qualidade de vida de uma pessoa e, portanto, um tratamento alternativo é desejado. O alotransplante composto vascularizado da laringe pode melhorar a capacidade do paciente de respirar e falar; no entanto, a pesquisa ainda é necessária antes que essa té…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Randall Raish por sua excelente videografia e assistência de edição.
Materials
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
References
- Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1676-1679 (2001).
- Hilgers, F. J. M., Ackerstaff, A. H., Aaronson, N. K., Schouwenburg, P. F., Zandwijk, N. Physical and psychosocial consequences of total laryngectomy. Clinical Otolaryngology. 15 (5), 421-425 (1990).
- Heyes, R., Iarocci, A., Tchoukalova, Y., Lott, D. G. Immunomodulatory role of mesenchymal stem cell therapy in vascularized composite allotransplantation. Journal of Transplantation. 2016, (2016).
- Kluyskens, P., Ringoir, S. Follow-up of a human larynx transplantation. Laryngoscope. 80 (8), 1244-1250 (1970).
- Krishnan, G., et al. The current status of human laryngeal transplantation in 2017: A state of the field review. Laryngoscope. 127 (8), 1861-1868 (2017).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), 950-953 (1992).
- Lorenz, R. R., Dan, O., Nelson, M., Fritz, M. A., Strome, M. Rat laryngeal transplant model: technical advancements and a redefined rejection grading system. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 111 (12), 1120-1127 (2002).
- Shipchandler, T. Z., et al. New mouse model for studying laryngeal transplantation. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 118 (6), 465-468 (2009).
- Strome, M., Wu, J., Strome, S., Brodsky, G. A comparison of preservation techniques in a vascularized rat laryngeal transplant model. The Laryngoscope. 104 (6), 666-668 (1994).
- Nocini, R., Molteni, G., Mattiuzzi, C., Lippi, G. Updates on larynx cancer epidemiology. Chinese Journal of Cancer Research. 32 (1), 18-25 (2020).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), (1992).
- Work, W. P., Boles, R. Larynx: Replantation in the dog. Archives of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 82 (4), 401-402 (1965).
- Birchall, M. A., et al. Model for experimental revascularized laryngeal allotransplantation. British Journal of Surgery. 89 (11), 1470-1475 (2002).
- Nakai, K., et al. Rat model of laryngeal transplantation with normal circulation maintained by combination with the tongue. Microsurgery. 23 (2), 135-140 (2003).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Long-term laryngeal allograft survival using low-dose everolimus. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 142 (1), 72-78 (2010).
- Lott, D. G., Russell, J. O., Khariwala, S. S., Dan, O., Strome, M. Ten-month laryngeal allograft survival with use of pulsed everolimus and anti-αβ T-cell receptor antibody immunosuppression. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 120 (2), 131-136 (2011).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Decoy NF-κB fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells. The Laryngoscope. 120 (1), 44-52 (2010).
