Perfil de todo el genoma de las interacciones de unión al factor de transcripción-ADN en Candida albicans: un método cut&RUN completo y un flujo de trabajo de análisis de datos
Summary
Este protocolo describe un método experimental y un flujo de trabajo de análisis de datos para la escisión bajo objetivos y la liberación utilizando nucleasa (CUT&RUN) en el patógeno fúngico humano Candida albicans.
Abstract
Los factores de transcripción reguladores controlan muchos procesos biológicos importantes, incluida la diferenciación celular, las respuestas a las perturbaciones y tensiones ambientales, y las interacciones huésped-patógeno. Determinar la unión de todo el genoma de los factores de transcripción reguladores al ADN es esencial para comprender la función de los factores de transcripción en estos procesos biológicos a menudo complejos. La escisión bajo objetivos y la liberación mediante nucleasa (CUT&RUN) es un método moderno para el mapeo de todo el genoma de las interacciones de unión proteína-ADN in vivo que es una alternativa atractiva a la inmunoprecipitación de cromatina tradicional y ampliamente utilizada seguida por el método de secuenciación (ChIP-seq). CUT&RUN es susceptible de una configuración experimental de mayor rendimiento y tiene un rango dinámico sustancialmente más alto con menores costos de secuenciación por muestra que ChIP-seq. Aquí, se describe un protocolo cut&RUN completo y el flujo de trabajo de análisis de datos que lo acompaña adaptado para el análisis de todo el genoma de las interacciones de unión al factor de transcripción-ADN en el patógeno fúngico humano Candida albicans . Este protocolo detallado incluye todos los procedimientos experimentales necesarios, desde el etiquetado de epítopos de genes codificantes de factores de transcripción hasta la preparación de bibliotecas para la secuenciación; además, incluye un flujo de trabajo computacional personalizado para el análisis de datos CUT&RUN.
Introduction
Candida albicans es un patógeno fúngico humano polimórfico clínicamente relevante que existe en una variedad de modos diferentes de crecimiento, como el modo de crecimiento planctónico (flotante libre) y como comunidades de células estrechamente adheridas protegidas por una matriz extracelular, conocida como el modo de crecimiento de biopelícula 1,2,3. Al igual que otros procesos de desarrollo y celulares, el desarrollo de biopelículas es un rasgo importante de virulencia de C. albicans que se sabe que está controlado a nivel transcripcional por factores de transcripción reguladores (TF) que se unen al ADN de una manera específica de la secuencia4. Recientemente, los reguladores de cromatina y los modificadores de histonas también han surgido como importantes reguladores de la formación de biopelículas de C. albicans 5 y la morfogénesis6 al mediar la accesibilidad del ADN. Para comprender la compleja biología de este importante patógeno fúngico, son valiosos los métodos efectivos para determinar la localización de todo el genoma de TF específicos durante distintos procesos de desarrollo y celulares.
La inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación (ChIP-seq) es un método ampliamente utilizado para investigar las interacciones proteína-ADN en C. albicans 5,6 y ha reemplazado en gran medida el método de inmunoprecipitación de cromatina más clásico seguido de microarray (ChIP-chip)9. Sin embargo, tanto los métodos ChIP-seq como ChIP-chip requieren un gran número de células de entrada10, lo que puede ser un factor complicado cuando se investigan TF en el contexto de muestras y modos de crecimiento específicos, como biopelículas recolectadas de pacientes o modelos animales de infección. Además, el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) a menudo produce una cantidad significativa de señal de fondo en todo el genoma, lo que requiere un alto nivel de enriquecimiento para que el objetivo de interés separe suficientemente la señal del ruido. Si bien el ensayo de chip ChIP está en gran medida desactualizado hoy en día, las profundidades de secuenciación necesarias para ChIP-seq hacen que este ensayo sea prohibitivamente costoso para muchos investigadores, particularmente aquellos que estudian múltiples TF y / o proteínas asociadas a la cromatina.
La escisión bajo objetivos y la liberación mediante nucleasa (CUT&RUN) es una alternativa atractiva a ChIP-seq. Fue desarrollado por el laboratorio Henikoff en 2017 para eludir las limitaciones de la escisión endógena ChIP-seq y la cromatina seguida de la secuenciación ChEC-seq11,12, otro método para identificar las interacciones proteína-ADN a nivel de todo el genoma, al tiempo que proporciona un mapeo de alta resolución de todo el genoma de TF y proteínas asociadas a la cromatina13 . CUT&RUN se basa en la digestión dirigida de la cromatina dentro de los núcleos permeabilizados utilizando nucleasas microcócicas atadas, seguidas de la secuenciación de los fragmentos de ADN digeridos 9,10. Como los fragmentos de ADN se generan específicamente en los loci que están unidos por una proteína de interés, en lugar de generarse en todo el genoma a través de la fragmentación aleatoria como en los ensayos ChIP, el enfoque CUT&RUN da como resultado señales de fondo muy reducidas y, por lo tanto, requiere 1/10de la profundidad de secuenciación en comparación con ChIP-seq11,13, 14. Estas mejoras conducen en última instancia a reducciones significativas en los costos de secuenciación y reducciones en el número total de células de entrada necesarias como material de partida para cada muestra.
Aquí, se describe un robusto protocolo CUT&RUN que ha sido adaptado y optimizado para determinar la localización de todo el genoma de TF en células de C. albicans aisladas de biopelículas y cultivos planctónicos. También se presenta una tubería de análisis de datos exhaustiva, que permite el procesamiento y análisis de los datos de secuencia resultantes y requiere que los usuarios tengan una experiencia mínima en codificación o bioinformática. Brevemente, este protocolo describe el etiquetado de epítopos de genes codificantes de TF, la recolección de biopelículas y células planctónicas, el aislamiento de núcleos permeabilizados intactos, la incubación con anticuerpos primarios contra la proteína específica o la proteína marcada con epítopos de interés, la vinculación de las proteínas de fusión quiméricas de nucleasa microcócica A / G (pAG-MNasa) a los anticuerpos primarios, la recuperación del ADN genómico después de la digestión de la cromatina y la preparación de bibliotecas de ADN genómico para la secuenciación.
El protocolo experimental CUT&RUN es seguido por una tubería de análisis de datos especialmente diseñada, que toma lecturas de secuenciación de ADN en bruto en formato FASTQ e implementa todos los pasos de procesamiento requeridos para proporcionar una lista completa de loci significativamente enriquecidos unidos por el TF de interés (dirigido por el anticuerpo primario). Tenga en cuenta que varios pasos del protocolo de preparación de bibliotecas descrito se han adaptado y optimizado específicamente para el análisis CUT&RUN de TF (a diferencia de los nucleosomas). Si bien los datos presentados en este manuscrito se generaron utilizando adaptaciones específicas de TF de un kit comercial CUT&RUN, estos protocolos también se han validado utilizando componentes de origen individual (es decir, enzima pAG-MNasa y perlas de purificación de ADN magnético) y tampones preparados internamente, lo que puede reducir significativamente el costo experimental. Los protocolos experimentales y de análisis de datos completos se describen en detalle a continuación en un formato paso a paso. Todos los reactivos y equipos críticos, así como las recetas de tampón y medios, se enumeran en la Tabla de Materiales y el Archivo Complementario 1, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo presenta una tubería experimental y computacional integral para la localización de todo el genoma de TF reguladores en C. albicans. Está diseñado para ser altamente accesible para cualquier persona con capacitación estándar en microbiología y biología molecular. Al aprovechar los requisitos de alto rango dinámico y bajo ingreso de muestra del ensayo CUT&RUN e incluir optimizaciones para la localización de las interacciones de unión TF-DNA en cultivos de biopelícula y planctónica d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los miembros pasados y presentes de los laboratorios Nobile y Hernday por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) número de premio R35GM124594 y por la familia Kamangar en forma de una silla dotada a C.J.N. Este trabajo también fue apoyado por el premio número R15AI137975 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) de los NIH a A.D.H.C.L.E. fue apoyado por el número de beca F31DE028488 del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial de los NIH (NIDCR). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa las opiniones de los financiadores. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis o interpretación de datos; en la redacción del manuscrito; o en la decisión de publicar los resultados.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
| 0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
| 1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
| 1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
| 12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| 5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
| Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
| Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
| Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
| Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
| Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
| Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
| curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
| DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
| DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
| E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
| ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
| End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
| FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
| FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
| Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
| Fluorescence microscope | User-dependent | ||
| Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
| GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
| GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
| GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
| HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
| High-speed centrifuge | User-dependent | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | |
| Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
| Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
| MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
| Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
| Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
| MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| NaCl | VWR | 470302-522 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
| NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
| NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
| Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
| Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
| Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
| pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
| pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
| pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
| pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
| pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
| pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
| pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
| Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
| Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
| Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
| Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
| SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
| Thermocycler | User-dependent | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
| Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
| Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
| UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
| USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
| Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
| wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| Yeast extract | Criterion | C7341 | |
| Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |
References
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