Genomweite Profilierung von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen in Candida albicans: Eine umfassende CUT&RUN-Methode und Datenanalyse-Workflow
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine experimentelle Methode und einen Datenanalyse-Workflow für die Spaltung unter Targets und die Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) im humanen Pilzpathogen Candida albicans.
Abstract
Regulatorische Transkriptionsfaktoren steuern viele wichtige biologische Prozesse, einschließlich der zellulären Differenzierung, der Reaktionen auf Umweltstörungen und -belastungen sowie der Wechselwirkungen zwischen Wirt und Krankheitserreger. Die Bestimmung der genomweiten Bindung von regulatorischen Transkriptionsfaktoren an die DNA ist essentiell, um die Funktion von Transkriptionsfaktoren in diesen oft komplexen biologischen Prozessen zu verstehen. Spaltung unter Targets und Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) ist eine moderne Methode zur genomweiten Kartierung von In-vivo-Protein-DNA-Bindungsinteraktionen, die eine attraktive Alternative zur traditionellen und weit verbreiteten Chromatin-Immunpräzipitationsmethode mit anschließender Sequenzierung (ChIP-seq) darstellt. CUT&RUN ist für einen experimentellen Aufbau mit höherem Durchsatz geeignet und hat einen wesentlich höheren Dynamikbereich mit niedrigeren Sequenzierungskosten pro Probe als ChIP-seq. Hier werden ein umfassendes CUT&RUN-Protokoll und ein begleitender Datenanalyse-Workflow beschrieben, der auf die genomweite Analyse von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen im menschlichen Pilzpathogen Candida albicans zugeschnitten ist. Dieses detaillierte Protokoll umfasst alle notwendigen experimentellen Verfahren, vom Epitop-Tagging von Transkriptionsfaktor-kodierenden Genen bis zur Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung; Darüber hinaus enthält es einen angepassten Berechnungsworkflow für die CUT&RUN-Datenanalyse.
Introduction
Candida albicans ist ein klinisch relevanter, polymorpher humaner Pilzpathogen, der in einer Vielzahl von verschiedenen Wachstumsmodi vorkommt, wie der planktonischen (frei schwebenden) Wachstumsweise und als Gemeinschaften eng haftender Zellen, die durch eine extrazelluläre Matrix geschützt sind, die als Biofilm-Wachstumsmodus 1,2,3 bekannt ist. Ähnlich wie bei anderen Entwicklungs- und zellulären Prozessen ist die Biofilmentwicklung ein wichtiges Virulenzmerkmal von C. albicans, von dem bekannt ist, dass es auf transkriptioneller Ebene durch regulatorische Transkriptionsfaktoren (TFs) gesteuert wird, die sequenzspezifisch an DNA binden4. In jüngster Zeit haben sich auch Chromatinregulatoren und Histonmodifikatoren als wichtige Regulatoren der Biofilmbildung5 von C. albicans und der Morphogenese6 herausgestellt, indem sie die DNA-Zugänglichkeit vermitteln. Um die komplexe Biologie dieses wichtigen Pilzpathogens zu verstehen, sind effektive Methoden zur Bestimmung der genomweiten Lokalisation spezifischer TFs während verschiedener Entwicklungs- und zellulärer Prozesse wertvoll.
Die Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender Sequenzierung (ChIP-seq) ist eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen in C. albicans5,6 und hat die klassischere Chromatin-Immunpräzipitation, gefolgt von der Microarray-Methode (ChIP-Chip)9, weitgehend ersetzt. Sowohl die ChIP-seq- als auch die ChIP-Chip-Methode erfordern jedoch eine große Anzahl von Inputzellen10, was bei der Untersuchung von TFs im Zusammenhang mit bestimmten Proben und Wachstumsweisen, wie Biofilmen von Patienten oder Tiermodellen der Infektion, ein komplizierender Faktor sein kann. Darüber hinaus liefert der Chromatin-Immunpräzipitations-Assay (ChIP) oft eine signifikante Menge an Hintergrundsignal im gesamten Genom, was ein hohes Maß an Anreicherung für das Ziel von Interesse erfordert, um Signal und Rauschen ausreichend zu trennen. Während der ChIP-Chip-Assay heute weitgehend veraltet ist, machen die für ChIP-seq erforderlichen Sequenzierungstiefen diesen Assay für viele Forscher unerschwinglich teuer, insbesondere für diejenigen, die mehrere TFs und / oder Chromatin-assoziierte Proteine untersuchen.
Spaltung unter Targets und Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) ist eine attraktive Alternative zu ChIP-seq. Es wurde 2017 vom Henikoff-Labor entwickelt, um die Einschränkungen der endogenen Spaltung von ChIP-seq und Chromatin zu umgehen, gefolgt von der Sequenzierung von ChEC-seq 11,12, einer weiteren Methode zur Identifizierung von Protein-DNA-Interaktionen auf genomweiter Ebene, während gleichzeitig eine hochauflösende, genomweite Kartierung von TFs und Chromatin-assoziierten Proteinen bereitgestelltwird 13 . CUT&RUN beruht auf der gezielten Verdauung von Chromatin in permeabilisierten Kernen unter Verwendung von angebundenen Mikrokokken-Nukleasen, gefolgt von der Sequenzierung der verdauten DNA-Fragmente 9,10. Da DNA-Fragmente spezifisch an den Loci erzeugt werden, die an ein interessantes Protein gebunden sind, anstatt wie bei ChIP-Assays im gesamten Genom durch zufällige Fragmentierung erzeugt zu werden, führt der CUT&RUN-Ansatz zu stark reduzierten Hintergrundsignalen und erfordert daher 1/10der Sequenzierungstiefe im Vergleich zu ChIP-seq11,13. 14. Diese Verbesserungen führen letztendlich zu einer deutlichen Reduzierung der Sequenzierungskosten und zu einer Verringerung der Gesamtzahl der Eingangszellen, die als Ausgangsmaterial für jede Probe benötigt werden.
Hier wird ein robustes CUT&RUN-Protokoll beschrieben, das für die Bestimmung der genomweiten Lokalisation von TFs in C. albicans-Zellen , die aus Biofilmen und planktonischen Kulturen isoliert wurden, angepasst und optimiert wurde. Darüber hinaus wird eine gründliche Datenanalyse-Pipeline vorgestellt, die die Verarbeitung und Analyse der resultierenden Sequenzdaten ermöglicht und den Benutzern nur minimale Kenntnisse in der Kodierung oder Bioinformatik erfordert. Kurz gesagt, beschreibt dieses Protokoll die Epitopmarkierung von TF-kodierenden Genen, die Ernte von Biofilm- und Planktonzellen, die Isolierung intakter permeabilisierter Kerne, die Inkubation mit primären Antikörpern gegen das spezifische Protein oder epitopmarkierte Protein von Interesse, die Anbindeglied der chimären A/G-Mikrokokken-Nuklease (pAG-MNase) Fusionsproteine an die primären Antikörper, die genomische DNA-Erholung nach der Chromatinverdauung und die Vorbereitung genomischer DNA-Bibliotheken für die Sequenzierung.
Auf das experimentelle CUT&RUN-Protokoll folgt eine speziell entwickelte Datenanalyse-Pipeline, die Roh-DNA-Sequenzierungslesevorgänge im FASTQ-Format durchführt und alle erforderlichen Verarbeitungsschritte implementiert, um eine vollständige Liste der signifikant angereicherten Loci zu erhalten, die durch die TF von Interesse gebunden sind (gezielt durch den primären Antikörper). Beachten Sie, dass mehrere Schritte des beschriebenen Bibliotheksvorbereitungsprotokolls speziell für die CUT&RUN-Analyse von TFs (im Gegensatz zu Nukleosomen) angepasst und optimiert wurden. Während die in diesem Manuskript präsentierten Daten mit TF-spezifischen Anpassungen eines kommerziellen CUT&RUN-Kits generiert wurden, wurden diese Protokolle auch mit einzeln beschafften Komponenten (d. H. pAG-MNase-Enzym und magnetischen DNA-Aufreinigungsperlen) und intern hergestellten Puffern validiert, was die experimentellen Kosten erheblich senken kann. Die umfassenden Experimental- und Datenanalyseprotokolle werden im Folgenden in einem Schritt-für-Schritt-Format detailliert beschrieben. Alle Reagenzien und kritischen Geräte sowie Puffer- und Medienrezepte sind in der Materialtabelle bzw. in der Ergänzungsdatei 1 aufgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt eine umfassende experimentelle und rechnerische Pipeline für die genomweite Lokalisierung regulatorischer TFs in C. albicans dar. Es wurde entwickelt, um für jeden mit Standard-Mikrobiologie- und Molekularbiologie-Ausbildung sehr zugänglich zu sein. Durch die Nutzung des hohen Dynamikbereichs und der geringen Anforderungen an den Probeneingang des CUT&RUN-Assays und die Einbeziehung von Optimierungen für die Lokalisierung von TF-DNA-Bindungsinteraktionen in C. albicans-Biofilm</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern der Laboratorien Nobile und Hernday für ihr Feedback zum Manuskript. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Award Nummer R35GM124594 und von der Familie Kamangar in Form eines Stiftungslehrstuhls für C.J.N. Diese Arbeit wurde auch durch den NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Award Nummer R15AI137975 an A.D.H unterstützt.C.L.E. wurde vom NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) Fellowship Nummer F31DE028488 unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht die Ansichten der Geldgeber dar. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie; bei der Erhebung, Analyse oder Interpretation von Daten; beim Schreiben des Manuskripts; oder bei der Entscheidung, die Ergebnisse zu veröffentlichen.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
| 0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
| 1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
| 1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
| 12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| 5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
| Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
| Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
| Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
| Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
| Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
| Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
| curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
| DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
| DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
| E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
| ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
| End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
| FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
| FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
| Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
| Fluorescence microscope | User-dependent | ||
| Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
| GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
| GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
| GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
| HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
| High-speed centrifuge | User-dependent | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | |
| Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
| Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
| MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
| Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
| Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
| MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| NaCl | VWR | 470302-522 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
| NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
| NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
| Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
| Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
| Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
| pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
| pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
| pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
| pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
| pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
| pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
| pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
| Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
| Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
| Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
| Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
| SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
| Thermocycler | User-dependent | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
| Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
| Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
| UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
| USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
| Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
| wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| Yeast extract | Criterion | C7341 | |
| Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |
References
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