Genomomfattande profilering av transkriptionsfaktor-DNA-bindande interaktioner i Candida albicans: En omfattande CUT & RUN-metod och dataanalysarbetsflöde
Summary
Detta protokoll beskriver en experimentell metod och dataanalysarbetsflöde för klyvning under mål och frisättning med nukleas (CUT & RUN) i den humana svamppatogenen Candida albicans.
Abstract
Regulatoriska transkriptionsfaktorer styr många viktiga biologiska processer, inklusive cellulär differentiering, svar på miljöstörningar och påfrestningar och värdpatogeninteraktioner. Att bestämma den genomomfattande bindningen av regulatoriska transkriptionsfaktorer till DNA är avgörande för att förstå transkriptionsfaktorernas funktion i dessa ofta komplexa biologiska processer. Klyvning under mål och frisättning med nukleas (CUT &RUN) är en modern metod för genomomfattande kartläggning av in vivo protein-DNA-bindande interaktioner som är ett attraktivt alternativ till den traditionella och allmänt använda kromatinimmunutfällningen följt av sekvenseringsmetod (ChIP-seq). CUT&RUN är mottaglig för en experimentell installation med högre genomströmning och har ett betydligt högre dynamiskt omfång med lägre sekvenseringskostnader per prov än ChIP-seq. Här beskrivs ett omfattande CUT &RUN-protokoll och tillhörande arbetsflöde för dataanalys skräddarsydd för genomomfattande analys av transkriptionsfaktor-DNA-bindande interaktioner i den humana svamppatogenen Candida albicans . Detta detaljerade protokoll innehåller alla nödvändiga experimentella procedurer, från epitopmärkning av transkriptionsfaktorkodande gener till biblioteksberedning för sekvensering; Dessutom innehåller den ett anpassat beräkningsarbetsflöde för CUT &RUN-dataanalys.
Introduction
Candida albicans är en kliniskt relevant, polymorf mänsklig svamppatogen som finns i en mängd olika tillväxtsätt, såsom det planktoniska (fritt flytande) tillväxtsättet och som samhällen av tätt vidhäftade celler skyddade av en extracellulär matris, känd som biofilmslägetför tillväxt 1,2,3. I likhet med andra utvecklings- och cellulära processer är biofilmutveckling ett viktigt C. albicans virulensdrag som är känt för att styras på transkriptionsnivå av regulatoriska transkriptionsfaktorer (TF) som binder till DNA på ett sekvensspecifikt sätt4. Nyligen har kromatinregulatorer och histonmodifierare också dykt upp som viktiga regulatorer för C. albicans biofilmbildning5 och morfogenes6 genom att förmedla DNA-tillgänglighet. För att förstå den komplexa biologin hos denna viktiga svamppatogen är effektiva metoder för att bestämma genomomfattande lokalisering av specifika TF under distinkta utvecklings- och cellulära processer värdefulla.
Kromatinimmunutfällning följt av sekvensering (ChIP-seq) är en allmänt använd metod för att undersöka protein-DNA-interaktioner i C. albicans 5,6 och har till stor del ersatt den mer klassiska kromatinimmunutfällningen följt av microarray (ChIP-chip)9-metoden. Både ChIP-seq- och ChIP-chip-metoder kräver dock ett stort antal indataceller10, vilket kan vara en komplicerande faktor vid undersökning av TF i samband med specifika prover och tillväxtsätt, såsom biofilmer som samlats in från patienter eller djurmodeller av infektion. Dessutom ger kromatinimmunutfällningsanalysen (ChIP) ofta en betydande mängd bakgrundssignal i hela genomet, vilket kräver en hög anrikningsnivå för målet av intresse för att tillräckligt separera signal från brus. Medan ChIP-chipanalysen till stor del är föråldrad idag, gör sekvenseringsdjupen som är nödvändiga för ChIP-seq denna analys oöverkomligt dyr för många forskare, särskilt de som studerar flera TF och / eller kromatinassocierade proteiner.
Klyvning under mål och frisättning med nukleas (CUT &RUN) är ett attraktivt alternativ till ChIP-seq. Det utvecklades av Henikoff-laboratoriet 2017 för att kringgå begränsningarna av ChIP-seq och kromatin endogen klyvning följt av sekvensering chEC-seq11,12, en annan metod för att identifiera protein-DNA-interaktioner på en genomomfattande nivå, samtidigt som man tillhandahåller högupplöst, genomomfattande kartläggning av TF och kromatinassocierade proteiner13 . CUT &RUN förlitar sig på riktad matsmältning av kromatin i permeabiliserade kärnor med hjälp av bundna mikrokocknukleaser, följt av sekvensering av de smälta DNA-fragmenten 9,10. Eftersom DNA-fragment genereras specifikt vid de loci som är bundna av ett protein av intresse, snarare än att genereras i hela genomet via slumpmässig fragmentering som i ChIP-analyser, resulterar CUT &RUN-metoden i kraftigt reducerade bakgrundssignaler och kräver därför 1/10 av sekvenseringsdjupet jämfört med ChIP-seq11,13, 14. Dessa förbättringar leder i slutändan till betydande minskningar av sekvenseringskostnaderna och minskningar av det totala antalet indataceller som behövs som utgångsmaterial för varje prov.
Här beskrivs ett robust CUT&RUN-protokoll som har anpassats och optimerats för att bestämma genomomfattande lokalisering av TF i C. albicans-celler isolerade från biofilmer och planktoniska kulturer. En grundlig dataanalyspipeline presenteras också, vilket möjliggör bearbetning och analys av de resulterande sekvensdata och kräver att användarna har minimal expertis inom kodning eller bioinformatik. Kortfattat beskriver detta protokoll epitopmärkning av TF-kodande gener, skörd av biofilm och planktoniska celler, isolering av intakta permeabiliserade kärnor, inkubation med primära antikroppar mot det specifika proteinet eller epitopmärkta proteinet av intresse, tethering av det chimära A / G-mikrokocknukleaset (pAG-MNase) fusionsproteinerna till de primära antikropparna, genomisk DNA-återhämtning efter kromatinförtunning och beredning av genomiska DNA-bibliotek för sekvensering.
Det experimentella CUT & RUN-protokollet följs av en specialbyggd dataanalyspipeline, som tar rå DNA-sekvenseringsläsningar i FASTQ-format och implementerar alla nödvändiga bearbetningssteg för att ge en komplett lista över signifikant berikade loci bundna av TF av intresse (riktad mot den primära antikroppen). Observera att flera steg i det beskrivna biblioteksberedningsprotokollet har anpassats specifikt och optimerats för CUT &RUN-analys av TF (i motsats till nukleosomer). Medan de data som presenteras i detta manuskript genererades med hjälp av TF-specifika anpassningar av ett kommersiellt CUT & RUN-kit, har dessa protokoll också validerats med hjälp av individuellt framställda komponenter (dvs. pAG-MNas-enzym och magnetiska DNA-reningspärlor) och internt beredda buffertar, vilket avsevärt kan minska experimentella kostnader. De omfattande experiment- och dataanalysprotokollen beskrivs i detalj nedan i ett steg-för-steg-format. Alla reagenser och kritisk utrustning, liksom buffert- och medierecept, listas i materialförteckningen respektive tilläggsfil 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll presenterar en omfattande experimentell och beräkningsmässig pipeline för genomomfattande lokalisering av regulatoriska TF i C. albicans. Den är utformad för att vara mycket tillgänglig för alla med standard mikrobiologi och molekylärbiologi utbildning. Genom att utnyttja det höga dynamiska omfånget och låga provinmatningskraven i CUT & RUN-analysen och inkludera optimeringar för lokalisering av TF-DNA-bindningsinteraktioner i C. albicans biofilm och planktoniska kulturer, pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar alla tidigare och nuvarande medlemmar i Nobile och Hernday laboratorier för feedback på manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) tilldelningsnummer R35GM124594 och av Kamangar-familjen i form av en begåvad stol till C.J.N. Detta arbete stöddes också av NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) tilldelningsnummer R15AI137975 till A.D.H.C.L.E. stöddes av NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) stipendienummer F31DE028488. Innehållet är författarnas eget ansvar och representerar inte finansiärernas åsikter. Finansiärerna hade ingen roll i utformningen av studien; vid insamling, analys eller tolkning av data, i skrivandet av manuskriptet eller i beslutet att offentliggöra resultaten.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
| 0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
| 1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
| 1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
| 12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| 5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
| Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
| Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
| Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
| Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
| Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
| Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
| curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
| DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
| DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
| E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
| ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
| End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
| FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
| FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
| Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
| Fluorescence microscope | User-dependent | ||
| Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
| GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
| GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
| GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
| HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
| High-speed centrifuge | User-dependent | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | |
| Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
| Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
| MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
| Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
| Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
| MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| NaCl | VWR | 470302-522 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
| NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
| NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
| Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
| Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
| Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
| pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
| pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
| pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
| pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
| pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
| pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
| pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
| Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
| Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
| Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
| Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
| SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
| Thermocycler | User-dependent | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
| Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
| Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
| UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
| USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
| Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
| wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| Yeast extract | Criterion | C7341 | |
| Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |
References
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
- Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
- Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
- Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
- Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
- Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
- Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
- Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
- Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
- Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).
