Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering
Summary
Het huidige protocol beschrijft monstervoorbereiding en gegevensanalyse om eiwitfosforylering te kwantificeren met behulp van een verbeterde single-molecule pull-down (SiMPull) assay.
Abstract
Fosforylering is een noodzakelijke posttranslationele modificatie die de eiwitfunctie reguleert en de celsignaleringsresultaten stuurt. De huidige methoden om eiwitfosforylering te meten, kunnen de heterogeniteit in fosforylering tussen individuele eiwitten niet behouden. De single-molecule pull-down (SiMPull) assay werd ontwikkeld om de samenstelling van macromoleculaire complexen te onderzoeken via immunoprecipitatie van eiwitten op een glazen coverslip gevolgd door single-molecule imaging. De huidige techniek is een aanpassing van SiMPull die robuuste kwantificering biedt van de fosforyleringstoestand van membraanreceptoren over de volledige lengte op het niveau van één molecuul. Door duizenden individuele receptoren op deze manier in beeld te brengen, kunnen eiwitfosforyleringspatronen worden gekwantificeerd. Het huidige protocol beschrijft de geoptimaliseerde SiMPull-procedure, van monstervoorbereiding tot beeldvorming. Optimalisatie van glaspreparatie- en antilichaamfixatieprotocollen verbetert de gegevenskwaliteit verder. Het huidige protocol biedt code voor de single-molecule data-analyse die de fractie van receptoren berekent die in een monster worden gefosforyleerd. Hoewel dit werk zich richt op fosforylering van de epidermale groeifactorreceptor (EGFR), kan het protocol worden gegeneraliseerd naar andere membraanreceptoren en cytosolische signaalmoleculen.
Introduction
Membraan-geassocieerde signalering wordt afgestemd door een combinatie van ligand-geïnduceerde membraanreceptoractivering en rekrutering van downstream accessoire-eiwitten die het signaal verspreiden. Fosforylering van belangrijke tyrosines in receptorcytoplasmatische staarten is van cruciaal belang voor het initiëren van de vorming van signaleringscomplexen, of signaalosomen 1,2. Daarom is een belangrijke vraag in de biologie hoe fosforyleringspatronen worden gecreëerd en onderhouden om signaalpartners te werven en cellulaire uitkomsten te dicteren. Dit omvat het begrijpen van de heterogeniteit van receptorfosforylering, zowel in overvloed als in de specifieke fosfotyrosinepatronen die een middel kunnen bieden om signaaluitgangen te manipuleren door de samenstelling van het signaalosoom 3,4,5,6,7 te dicteren. Er zijn echter beperkingen in de huidige methoden om eiwitfosforylering te ondervragen. Western blot-analyse is uitstekend voor het beschrijven van trends van eiwitfosforylering, maar is semikwantitatief8 en geeft geen informatie over de heterogeniteit van het systeem omdat duizenden tot miljoenen receptoren samen worden gemiddeld. Hoewel western blots het mogelijk maken om een monster te onderzoeken met behulp van fosfo-specifieke antilichamen tegen specifieke tyrosines, kunnen ze geen informatie geven over multisite fosforyleringspatronen binnen hetzelfde eiwit. Kwantitatieve fosfoproteomica rapporteren over de abundantie van fosfoyrosine, maar er zijn beperkingen aan het detecteren van multisietfosforylering, omdat de residuen van belang zich moeten bevinden in hetzelfde peptide (meestal 7-35 aminozuren) dat wordt gegenereerd door enzymatische vertering 9,10,11.
Om de hierboven genoemde beperkingen te overwinnen, is de single-molecule pull-down (SiMPull) assay aangepast om de fosforyleringstoestanden van intacte receptoren op het niveau van één molecuul te kwantificeren. SiMPull werd voor het eerst gedemonstreerd als een krachtig hulpmiddel voor het ondervragen van macromoleculaire complexen door Jain et al.12,13. In SiMPull werden macromoleculaire complexen immunoprecipitated (IP) op antilichaam-gefunctionaliseerde glazen coverslips en vervolgens geanalyseerd door middel van single-molecule microscopie voor eiwit subunitnummer en co-IP met complexe componenten12. Een modificatie door Kim et al.14, genaamd SiMBlot, was de eerste die een variatie van SiMPull gebruikte om fosforylering van gedenatureerde eiwitten te analyseren. Het SiMBlot-protocol is gebaseerd op het vastleggen van gebiotinyleerde celoppervlakeiwitten met behulp van NeutrAvidin-gecoate coverslips, die vervolgens worden onderzocht op fosforylering met fosfo-specifieke antilichaametikettering14. Ondanks deze vooruitgang waren verbeteringen nodig om de kwantificering van posttranslationele modificatie robuuster en toepasbaarder te maken voor een breder scala aan eiwitten.
Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde SiMPull-benadering die werd gebruikt om fosforyleringspatronen van intacte epidermale groeifactorreceptor (EGFR) te kwantificeren als reactie op een reeks ligandcondities en oncogene mutaties15. Hoewel dit werk zich richt op EGFR, kan deze aanpak worden toegepast op elke membraanreceptor en cytosolische eiwitten van belang (POI), waarvoor kwaliteitsantistoffen beschikbaar zijn. Het protocol bevat stappen om de autofluorescentie van monsters te verminderen, een ontwerp van een monsterarray dat een minimaal monstervolume vereist met gelijktijdige voorbereiding van maximaal 20 monsters, en optimalisatie van antilichaametikettering en fixatieomstandigheden. Data-analyse-algoritmen zijn ontwikkeld voor detectie en kwantificering van gefosforyleerde eiwitten met één molecuul.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol is geoptimaliseerd om kwantitatieve metingen van receptorfosforylering op het niveau van één eiwit mogelijk te maken. Verschillende eenvoudige maar belangrijke wijzigingen in het SiMPull-protocol werden ontwikkeld die de betrouwbaarheid van de meting voor fosfo-tyrosinedetectie verbeterden, waaronder vermindering van autofluorescentie met NaBH4-behandeling en postfixatie van het monster om antilichaamdissociatie te voorkomen. Het gebruik van het groene kanaalmasker om receptorloc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 en R01CA248166 to DSL. EMB werd ondersteund door het ASERT-IRACDA-programma (NIH K12GM088021) en JAR door het UNM MARC-programma (NIH 2T34GM008751-20). We erkennen dankbaar het gebruik van de gedeelde bron van fluorescentiemicroscopie van het University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, ondersteund door NIH P30CA118100. We willen Drs. Ankur Jain en Taekijip Ha erkennen, wiens oorspronkelijke ontwikkeling van SiMPull dit werk inspireerde.
ES-C presenteer adres: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
References
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
- Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
- Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. 생화학. 39 (19), 5738-5749 (2000).
- Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
- Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
- Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
- Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
- Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. . Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
- fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013)
- Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
- Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
