Stabilire gli organoidi dal dente umano come un potente strumento verso la ricerca meccanicistica e la terapia rigenerativa

Summary

Presentiamo un protocollo per sviluppare colture organoidi epiteliali a partire dal dente umano. Gli organoidi sono robustamente espandibili e ricapitolano le cellule staminali epiteliali del dente, compresa la loro capacità di differenziazione degli ameloblasti. L’esclusivo modello organoide fornisce uno strumento promettente per studiare la biologia dentale umana (cellule staminali) con prospettive per approcci rigenerativi dei denti.

Abstract

I denti sono di fondamentale importanza nella vita non solo per la masticazione alimentare e la parola, ma anche per il benessere psicologico. Le conoscenze sullo sviluppo e la biologia dei denti umani sono scarse. In particolare, non si sa molto sulle cellule staminali epiteliali del dente e sulla loro funzione. Siamo riusciti a sviluppare un nuovo modello organoide a partire dal tessuto dentale umano (cioè follicolo dentale, isolato dai denti del giudizio estratti). Gli organoidi sono espandibili in modo robusto e a lungo termine e ricapitolano il compartimento delle cellule staminali epiteliali del dente umano proposto in termini di espressione del marcatore e attività funzionale. In particolare, gli organoidi sono in grado di dispiegare un processo di differenziazione degli ameloblasti come avviene in vivo durante l’amelogenesi. Questo modello unico di organoidi fornirà un potente strumento per studiare non solo lo sviluppo dei denti umani, ma anche la patologia dentale e potrebbe aprire la strada alla terapia rigenerativa dei denti. La sostituzione dei denti persi con un dente biologico basato su questo nuovo modello organoide potrebbe essere un’alternativa interessante all’attuale impianto standard di materiali sintetici.

Introduction

I denti hanno ruoli essenziali nella masticazione alimentare, nella parola e nel benessere psicologico (immagine di sé). Il dente umano è costituito da tessuti altamente mineralizzati di varia densità e durezza¹. Lo smalto dentale, il componente principale della corona del dente, è il tessuto mineralizzato più alto del corpo umano. Durante la formazione dello smalto (amelogenesi), quando i denti si sviluppano, le cellule staminali epiteliali dentali (DESC) si differenziano in cellule che formano lo smalto (ameloblasti). Una volta formato, lo smalto viene raramente riparato o rinnovato a causa della perdita apoptotica degli ameloblasti all’inizio dell’eruzione dentale¹. Il ripristino del tessuto smaltato danneggiato, causato da traumi o malattie batteriche, viene attualmente effettuato utilizzando materiali sintetici; tuttavia, questi sono turbati da importanti carenze come il microleakage, l’osteointegrazione e l’ancoraggio inferiori, la durata della vita finita e la mancanza di riparazione completamente funzionale². Quindi, una coltura robusta e affidabile di DESC umani con la capacità di generare ameloblasti e il potenziale per produrre tessuto mineralizzato sarebbe un importante passo avanti nel campo rigenerativo dentale.

Le conoscenze sul fenotipo DESC umano e sulla funzione biologica sono scarse ^3,4,5. È interessante notare che i DESC dei denti umani sono stati proposti per esistere nei resti delle cellule epiteliali di Malassez (ERM), cluster cellulari presenti all’interno del follicolo dentale (DF), che circonda i denti non eruttati e rimane presente nel legamento parodontale intorno alla radice una volta che il dente erutta¹. È stato scoperto che le cellule ERM co-coltivate con polpa dentale si differenziano in cellule simili agli ameloblasti e generano tessuto simile allo smalto⁶. Tuttavia, studi approfonditi sul ruolo specifico delle cellule ERM nella (ri)generazione dello smalto sono stati limitati a causa della mancanza di modelli di studio affidabili⁷. Gli attuali sistemi di coltura in vitro ERM sono ostacolati da una durata di vita limitata e da una rapida perdita di fenotipo nelle condizioni 2D utilizzate standardmente 8,9,10,11,12. Quindi, un sistema trattabile in vitro per espandere, studiare e differenziare fedelmente i DESC umani è fortemente necessario.

Durante l’ultimo decennio, una potente tecnica per coltivare cellule staminali epiteliali in vitro è stata applicata con successo a diversi tipi di tessuti epiteliali (umani) per studiare la loro biologia e la malattia 13,14,15,16. Questa tecnologia consente alle cellule staminali epiteliali tissutali di auto-svilupparsi in costruzioni cellulari 3D (cioè organoidi) quando seminate in un’impalcatura che imita la matrice extracellulare (ECM) (tipicamente, Matrigel) e coltivate in un mezzo definito che replica la segnalazione di nicchia delle cellule staminali del tessuto e / o l’embriogenesi. I fattori di crescita tipici necessari per lo sviluppo di organoidi includono il fattore di crescita epidermico (EGF) e gli attivatori del sito di integrazione MMTV di tipo alare (WNT) 14,15,16. Gli organoidi risultanti sono caratterizzati da una fedeltà duratura nell’imitare le cellule staminali epiteliali originali del tessuto, nonché da un’elevata espandibilità pur mantenendo il loro fenotipo e le loro proprietà funzionali, superando così la disponibilità di tessuto umano primario spesso limitata acquisita dalla clinica. Per stabilire gli organoidi, non è necessario l’isolamento delle cellule staminali epiteliali dal tessuto eterogeneo (cioè comprendente altri tipi di cellule come le cellule mesenchimali) prima della coltura poiché le cellule mesenchimali non si attaccano o prosperano nell’ECM, risultando infine in organoidi puramente epiteliali 13,16,17,18,19 . Questa tecnologia promettente e versatile ha portato allo sviluppo di molteplici modelli organoidi da vari tessuti epiteliali umani. Tuttavia, gli organoidi derivati dai denti umani, preziosi per lo studio approfondito dello sviluppo, della rigenerazione e della malattia dei denti, non sono stati ancora stabiliti^20,21. Recentemente siamo riusciti a sviluppare un nuovo modello organoide a partire dal tessuto DF di terzi molari (denti del giudizio) estratti da pazienti adolescenti¹⁹.

Qui, descriviamo il protocollo per sviluppare colture organoidi epiteliali dal dente umano adulto (cioè dal DF dei terzi molari) (Figura 1A). Gli organoidi risultanti esprimono marcatori di stelo associati all’ERM pur essendo espandibili a lungo termine. Curiosamente, contrariamente alla maggior parte degli altri modelli di organoidi, l’EGF tipicamente necessario è ridondante per uno sviluppo e una crescita robusti di organoidi. È interessante notare che gli organoidi di staminale mostrano proprietà di differenziazione degli ameloblasti, imitando così le caratteristiche e i processi ERM / DESC che si verificano in vivo. Il nuovo e unico modello organoide qui descritto consente di esplorare la biologia, la plasticità e la capacità di differenziazione DESC e apre la porta per fare i primi passi verso approcci rigenerativi dei denti.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato Etico ricerca UZ/KU Leuven (13/0104U). I terzi molari estratti (denti del giudizio) sono stati ottenuti dopo il consenso informato dei pazienti. 1. Preparativi Preriscaldare una piastra di coltura a 48 pozzetti per 15-20 ore in un incubatore CO2 all’1,9 % a 37 °C. Liquefare un’aliquota di Matrigel (fattore di crescita ridotto; priva di fenolo rosso; ulteriormente indicata come matric…

Representative Results

Sviluppo organoide dentaleForniamo un protocollo dettagliato per stabilire colture organoidi da tessuto DF umano acquisito dopo l’estrazione del dente del giudizio (Figura 1A). Il DF isolato è dissociato enzimaticamente e meccanicamente. Le cellule ottenute vengono coltivate all’interno di BMM in mezzi che sono stati definiti empiricamente per lo sviluppo e la crescita ottimale degli organoidi (mezzo organoide dentale; TOM)19. <p class="jove_…

Discussion

Questo protocollo descrive la generazione efficiente e riproducibile di organoidi a partire dal dente umano. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima metodologia per stabilire organoidi di concetto corrente (epiteliali) a partire dal tessuto dentale umano. Gli organoidi sono espandibili a lungo termine e mostrano un fenotipo di staminalità epiteliale dentale, duplicando i DESC precedentemente riportati nel compartimento ERM del DF⁷. Inoltre, gli organoidi replicano le caratteristiche funzionali…

Materials

1.5 mL Microcentrifuge tube	Eppendorf	30120.086
15 mL Centrifuge tube	Corning	430052
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-6250
48-well flat bottom plates	Corning	3548
50 mL Centrifuge tube	Corning	430290
A83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Agarose	Lonza	50004
Albumin Bovine (cell culture grade)	Serva	47330.03
AMELX antibody	Santa Cruz	sc-365284
Amphotericin B	Gibco	15200018
B27 (without vitamin A)	Gibco	12587-010
Cassette	VWR	7202191
Catalase from bovine liver	Sigma-Aldrich	C100
CD44 antibody	Abcam	ab34485
Cell strainer, 40 µm	Falcon	352340
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Citric acid	Sigma-Aldrich	C0759
CK14 antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-11599
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Cover glass	VWR	6310146
Cryobox	Thermo Scientific	5100-0001
Cryovial	Thermo Fisher Scientific	375353
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMEM 1:1 F12 without Fe	Invitrogen	074-90715A
DMEM powder high glucose	Gibco	52100039
Dnase	Sigma-Aldrich	D5025-15KU
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663 – 10ML
Embedding workstation, 220 to 240 Vac	Thermo Fisher Scientific	12587976
Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH)	Fisher Chemical	E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
FGF10	Peprotech	100-26
FGF2 (= basic FGF)	R&D Systems	234-FSE-025
FGF8	Peprotech	AF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit	Sigma-Aldrich	RTN350-1KT	Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer
Glass Pasteur pipette	Niko Mechanisms	170-40050
Glycine	VWR	101194M
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
IGF-1	PeproTech	100-11
InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI)	Sigma-Aldrich	688001
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I6634
ITGA6 antibody	Sigma-Aldrich	HPA012696
L-Glutamine	Gibco	25030024
Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free)	Corning	15505739
Microscope slide	Thermo Fisher Scientific	J1800AMNZ
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm	Millipore	SLGV033R
Minimum essential medium eagle (αMEM)	Sigma-Aldrich	M4526
mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-31570
N2	Gibco	17502-048
N-acetyl L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	120-10C
P63 antibody	Abcam	ab124762
Pap Pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Marking pen
Paraformaldehyde (PFA), 16%	Merck	8.18715
Penicillin G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Penicillin-streptomycin (Pen/Strep)	Gibco	15140-122
Petri dish	Corning	353002
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-015
Pipette (P20, P200, P1000)	Eppendorf or others	2231300006
Plastic transfer pipette (3.5 mL)	Sarstedt	86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A21206
RSPO1	PeproTech	120-38
SB202190 (p38i)	Biotechne (Tocris)	1264
Scalpel (surgical blade)	Swann-Morton	207
SHH	R&D Systems	464-SH-200
Silicone molds (Heating block)	VWR	720-1918
Sodium Chloride (NaCl)	BDH	102415K
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)	Merck	106329
Sodium-pyruvate (C3H3NaO3)	Sigma-Aldrich	P-5280
SOX2 antibody	Abcam	ab92494
StepOnePlus	Thermo Fisher Scientific		Real-Time PCR System
Stericup-GP, 0.22 µm	Millipore	SCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm	Millipore	SCGP00525
Sterile 1000 μL pipette tips with filter	Greiner	740288
Sterile 20 μL pipette tips with filter	Greiner	774288
Sterile 200 μL pipette tips with and without filter	Greiner	739288
Sterile H2O	Fresenius	B230531
Streptomycin sulfate salt	Sigma-Aldrich	S6501
Superscript III first-strand synthesis supermix	Invitrogen	11752-050	Reverse transcription kit
Tissue processor	Thermo Scientific	12505356
Transferrin	Serva	36760.01
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
TrypLE express	Gibco	12605-010
Vectashield mounting medium+DAPI	Labconsult NV	H-1200	Antifade mounting medium with DAPI
WNT3a	Biotechne (Tocris)	5036-WN-500
Xylenes, 99%, for biochemistry and histology	VWR	2,89,75,325