El presente protocolo detalla la preparación y visualización del tejido fijo del notum pupal de Drosophila . Se puede utilizar para el tejido intacto o herido, y se conserva la arquitectura original del tejido. Los procedimientos para diseccionar, fijar y teñir se describen en este artículo.
Las pupas de Drosophila melanogaster están inmóviles durante varios días durante la metamorfosis, durante los cuales desarrollan un nuevo cuerpo con un tegumento adulto delgado y transparente. Su inmovilidad y transparencia los hacen ideales para experimentos de imágenes en vivo in vivo . Muchos estudios se han centrado en la monocapa epitelial dorsal del notum pupal debido a su accesibilidad y tamaño relativamente grande. Además de los estudios de mecánica epitelial y desarrollo, el notum ha sido un tejido ideal para estudiar la cicatrización de heridas. Después de una lesión, todo el proceso de reparación epitelial se puede capturar mediante imágenes en vivo durante 6-12 h. A pesar de la popularidad del notum para imágenes en vivo, muy pocos estudios publicados han utilizado muestras fijas de notum. La fijación y la tinción son enfoques comunes para casi todos los demás tejidos de Drosophila, aprovechando el gran repertorio de tinciones celulares simples y anticuerpos. Sin embargo, el notum pupal es frágil y propenso al rizo y la distorsión después de la eliminación del cuerpo, por lo que es difícil complementar las imágenes en vivo. Este protocolo ofrece un método sencillo para fijar y teñir el notum pupal, tanto intacto como después de la herida con láser. Con esta técnica, el lado ventral de la pupa se pega a una funda para inmovilizar la pupa, y el notum se retira, fija y tiñe cuidadosamente. El epitelio notum se monta en un portaobjetos o entre dos fundas para facilitar la obtención de imágenes desde el lado dorsal o ventral del tejido.
El notum pupal de Drosophila melanogaster se ha utilizado cada vez más para estudios de imágenes en vivo en la última década porque el animal está inmóvil y tiene una cutícula transparente en esta etapa 1,2,3,4,5,6,7. Sin embargo, el notum pupal es difícil de diseccionar y arreglar, lo que dificulta complementar los estudios de imágenes en vivo con la tinción de anticuerpos y células. El objetivo general de este trabajo es crear un protocolo reproducible para diseccionar y fijar el notum pupal para la tinción de anticuerpos y células en muestras nuevas o previamente fotografiadas en vivo.
A medida que las larvas comienzan la metamorfosis, la epidermis se aleja de la cutícula larvaria, formando una caja pupal dura8. El plan corporal larvario se descompone y se desarrolla el nuevo plan corporal adulto. Durante este tiempo, las pupas están inmóviles, lo que las hace ideales para imágenes en vivo. Un tejido comúnmente fotografiado es el notum pupal, un epitelio monocapa adulto que se forma en el tórax dorsal. El notum es visualmente accesible después de una simple disección para eliminar el caso pupal9. Luego se puede montar todo el animal, y el notum se puede obtener imágenes en vivo durante horas o días, lo que lo convierte en un tejido ideal para estudiar los comportamientos de las células epiteliales durante el desarrollo, la homeostasis y después de la herida 10,11,12,13,14. Sin embargo, el notum es difícil de diseccionar y arreglar porque es frágil y está cubierto con una delgada cutícula adulta transparente que es hidrofóbica. Esta cutícula hidrofóbica la hace propensa a enroscarse en soluciones acuosas cuando se retira del resto del cuerpo. Por lo tanto, la disección y fijación notum se ha reportado solo en raras ocasiones y la disección a menudo no se describe 15,16,17,18. Sin un protocolo detallado en la literatura, es prohibitivamente difícil para un investigador de Drosophila complementar las imágenes vivas con la tinción de pupas.
Esta técnica tiene como objetivo diseccionar y fijar de forma reproducible muestras que han sido previamente fotografiadas en vivo, incluidas las que han sido heridas con láser. Debido a que las imágenes en vivo requieren la eliminación del caso pupal, esta técnica de disección comienza por eliminar el caso pupal anterior, a diferencia de los protocolos anteriores que fijan o bisectan pupas dentro del caso pupal 4,19,20. El notum es un tejido frágil, y las heridas pueden exacerbar su fragilidad. Por lo tanto, para soportar este delicado tejido, el tegumento (el epitelio y la cutícula adulta transparente adjunta) del notum y parte de la cabeza y el abdomen se diseccionan lejos del resto de la pupa mientras siempre se sumergen en un ambiente acuoso. Este método reduce la probabilidad de que el tejido se enrosque y sea inutilizable. Esta técnica ha teñido con éxito el tejido notum herido tan pronto como 30 min después de la herida (Figura 1E-H) y a las 3 h después de la herida (Figura 1I-L). Se espera que este protocolo sea efectivo durante la duración del desarrollo de notum o la reparación de heridas. La técnica actual será útil para los investigadores que deseen unir las capacidades de imágenes en vivo del notum pupal con la abundancia de reactivos inmunohistoquímicos disponibles.
Pasos críticos
La optimización de tres pasos aumentará drásticamente el éxito de este protocolo. Primero, en el paso 1.5, ahorre con el pegamento adhesivo aplicado a la cubierta. Si se agrega demasiado pegamento adhesivo, las pupas pueden quedar enterradas en una capa gruesa de pegamento adhesivo solidificado, lo que hará imposible la disección, y si cubre el notum en sí, el pegamento adhesivo ocluirá la luz de la muestra. En segundo lugar, durante los pasos 2.3-2.6, asegúrese de eliminar solo la cúpula superior del notum, excluyendo la mayor cantidad posible del tejido lateral. Si se incluye, el tejido lateral se comprimirá durante el montaje y hará que el centro del notum se doble hacia adentro, a menudo colocándolo fuera de la distancia de trabajo de los objetivos de alta apertura numérica. En tercer lugar, durante la etapa de limpieza 2.9, se debe tener mucho cuidado de no dañar el epitelio monocapa. Si al tejido le faltan grandes porciones o no se puede detectar ninguna señal, es probable que este paso sea el culpable.
Solución de problemas
Problema 1: Después del montaje, la pupa se desprende de la cinta de doble cara durante la disección. Este es un problema común, especialmente para los principiantes. El mejor remedio es asegurarse de que el exterior de la caja de pupas esté completamente seco / libre de restos de alimentos. Quitar los alimentos con un par de fórceps contundentes y dejar que el estuche se seque al aire durante 10-15 minutos ayudará a adherirse a la cinta. Alternativamente, use la mano no dominante y un par de fórceps contundentes para sostener las pupas contra la cinta durante la disección. Si el problema persiste, aplicar una pequeña gota de esmalte de uñas de 5-10 μL en la base del extremo posterior de la caja y permitir que se endurezca generalmente proporciona suficiente adherencia incluso para las pupas más rebeldes.
Problema 2: Notum se colapsa durante el paso 2.3, o la brecha inicial a través del tegumento no es suave. Si el tegumento es difícil de romper, puede haber demasiado pegamento adhesivo de los pasos de inmovilización. Colocar las pupas disecadas en menos pegamento adhesivo mejorará este problema. Además, asegúrese de que las tijeras de microdisección sean afiladas. Las tijeras romas no podrán cortar el tegumento y tienden a hacer que colapse hacia adentro. Una vez que la hemolinfa se derrame fuera de las pupas, asegúrese de que una de las cuchillas de corte pueda ingresar a la pupa sin causar que el notum se deforme. Si el notum colapsa y la cuchilla no entra en la pupa, continúe cortando hasta que una cuchilla entre en las pupas.
Problema 3: Durante el paso 2.4, las tijeras atrapan o arrastran el tegumento. Si las tijeras comienzan a atrapar o arrastrar el tegumento, a menudo ayuda cambiar al lado opuesto de las pupas y proceder a “aflojar” el tegumento. Otras tijeras de microdisección romas dificultarán el logro de cortes limpios a través del tegumento, y se deben usar tijeras afiladas.
Problema 4: La muestra se aspira accidentalmente durante la tinción (pasos 3.1-3.6). El notum diseccionado es difícil de ver porque es transparente. Puede ser útil colocar una sábana azul oscuro o negra debajo de la cubierta para proporcionar contraste (un viejo bastidor de soporte de punta de pipeta funciona bien). Además, todos los cambios en la solución se pueden realizar bajo un microscopio de disección.
Problema 5: No se detecta ninguna señal/se detecta una señal irregular. Después de descartar problemas específicos de manchas, si no se detecta ninguna señal o es irregular, es probable que el paso 2.9 (limpieza) sea el culpable. Una señal ausente o irregular puede originarse por el daño y la eliminación del tejido epitelial durante la limpieza. Por el contrario, una señal deficiente puede ser causada por la oclusión de las bandas musculares / células grasas del cuerpo si no se eliminan, ya que pueden limitar la difusión de manchas y anticuerpos en el notum en relación con el tejido circundante. Si el tejido está dañado, ser más suave durante la limpieza es la mejor solución. Si, en cambio, la mancha es visible pero irregular, se recomienda aumentar el vigor / tiempo dedicado al paso de limpieza para eliminar la mayor cantidad posible del músculo y la grasa del cuerpo. Además, aumentar la duración de la mancha puede ayudar a resolver este problema con una mejor limpieza.
Problema 6: El tejido notum tiene una apariencia deformada / arrugada durante la toma de imágenes. La deformación y las arrugas del tejido provienen de dos fuentes. Primero, comprimir el notum durante el montaje hará que se doble y se deforme. La mejor solución es eliminar la mayor cantidad posible de los tejidos laterales para que la cúpula sea lo más corta posible y pueda caber entre los espaciadores de la cubierta. En segundo lugar, si el notum se dobla durante la disección, esta curva no se enderezará durante el montaje, por lo que se debe tener especial cuidado de no deformar el notum durante la disección. La flexión accidental del notum es más común cuando se corta el tegumento lejos del resto de las pupas. Es tentador tener las tijeras de disección en un ángulo relativo a las pupas en lugar de mantenerlas en el plano de muestra como las pupas. Sin embargo, las tijeras en ángulo hacen que el tegumento se doble hacia arriba cuando se corta en lugar de permanecer plano.
Métodos existentes, limitaciones y aplicaciones futuras
Wang et al.20 reportaron un protocolo de disección comparable para el aislamiento del epitelio pupal. Esta técnica requiere que la pupa permanezca dentro de su estuche y se divida rápidamente con un bisturí. Este protocolo es incompatible con las muestras previamente fotografiadas en vivo, ya que las imágenes en vivo requieren la eliminación de una gran sección de la caja de pupa. Debido a que las pupas carecen de rigidez, la bisección de pupas fuera de la caja destrozó el tejido, inspirando la creación de este protocolo. La técnica detallada aquí permite el aislamiento y la fijación del notum, y podría usarse como el primer paso para una amplia gama de otros métodos como la crioseccionación, la hibridación in situ o la microscopía electrónica.
Esta técnica tiene algunas limitaciones. En primer lugar, diseccionar, fijar y teñir el notum consume más tiempo que las proteínas marcadas fluorescentemente con imágenes en vivo en el notum, lo que requiere solo una disección simple para eliminar el caso pupal 9,23. En segundo lugar, en comparación con las disecciones de otros tejidos de Drosophila, esta disección es más difícil debido al tejido delgado y frágil y la cutícula hidrofóbica. Para simplemente visualizar proteínas en Drosophila epithelia, la inmunohistoquímica en embriones fijos, discos de alas larvales u ovarios es más fácil. Sin embargo, esta técnica permite que el poder de las imágenes en vivo se combine con la fijación y la tinción, lo que la convierte en una herramienta poderosa una vez dominada.
Una técnica de disección/ fijación tiene algunas ventajas sobre las imágenes en vivo. Las estructuras basales (interiores) se pueden resolver mejor con una vista basal (Figura 5L,J). Lo más importante es que las imágenes en vivo se limitan a los fluoróforos que deben suministrarse genéticamente, lo que a menudo requiere largos esquemas de cruce genético. Por el contrario, el presente protocolo permite la aplicación de tinciones, inmunohistoquímica y otras técnicas que requieren disección y fijación. Esto aumenta drásticamente el número de señales sondeadas en el tejido, al tiempo que disminuye potencialmente el tiempo hasta los resultados experimentales.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer al Dr. M. Shane Hutson por establecer el sistema de ablación con láser utilizado para las heridas de pupa y sus contribuciones y comentarios sobre el desarrollo del protocolo. Este trabajo fue apoyado por 1R01GM130130 a APM y M. Shane Hutson. JW fue soportado por 2T32HD007502-21.
½” Scotch Permanent Double-Sided tape | Scotch 3M | 665 | |
0.1-10 µL uTIP pipette tip | Biotix | M-0011-9FC | |
22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips | Thomas Scientific | 1207Z28 | |
24 x 60 mm coverslip | Corning | 2980-246 | |
3M VetBond | 3M | 1469SB | Called "adhesive glue" in protocol |
Anti-FasIII primary Mouse IgG2a | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | |
Calcium Chloride | Fisher Chemical | c79-500 | |
Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a | Jackson ImmunoResearch | 115-165-206 | |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542-1mg | |
Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | No. 11254-20 | |
Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt | Fine Science Tools | No. 11254-20 | Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone |
Fisherbrand Double frosted microscope slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
Fluorescent Light Source | Lumencor | Celesta 90-10512 | |
Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A | Bloomington Drosophila Stock Center | 24163 | |
Fly Vial Foam Plugs "Flugs" | Genesee Scientific | 49-101 | |
Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water | Cole-Parmer | 759075D | A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water. |
KimWipe | KimTech | 34155 | Called "Absorbent Tissue" in protocol |
Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
NIS Elements Software | Nikon | AR | |
Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
Paraformaldehyde (PFA) 16% | Ted Pella, Inc | 18505 | |
Plastic Vials | Genesee Scientific | 32-114 | |
Sodium Azide (NaN3) | Fisher Scientific | 19038-1000 | |
Stereo Microdissection Scope | Carl Zeiss | STEMI 2000 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | New or freshly sharpened scissors |
Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | Called " antifade mounting medium" in protocol |
Vecta Shield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Not ideal for pupal notum. |
X-Light V2 Spinning Disc | Crest Optics | V2 L-FOV |