Оценка митохондриальной функции в седалищном нерве с помощью респирометрии высокого разрешения
Summary
Респирометрия высокого разрешения в сочетании с флуоресцентными датчиками определяет потребление митохондриального кислорода и генерацию активных форм кислорода (АФК). Настоящий протокол описывает метод оценки скорости дыхания митохондрий и продукции АФК в пермеабилизированном седалищном нерве.
Abstract
Митохондриальная дисфункция в периферических нервах сопровождает несколько заболеваний, связанных с периферической невропатией, которые могут быть вызваны несколькими причинами, включая аутоиммунные заболевания, диабет, инфекции, наследственные расстройства и опухоли. Оценка митохондриальной функции в периферических нервах мыши может быть сложной задачей из-за небольшого размера выборки, ограниченного количества митохондрий, присутствующих в ткани, и наличия миелиновой оболочки. Метод, описанный в этой работе, минимизирует эти проблемы, используя уникальный протокол пермеабилизации, адаптированный из того, который используется для мышечных волокон, для оценки митохондриальной функции седалищного нерва вместо выделения митохондрий из ткани. Измеряя продукцию флуориметрических реактивных видов с помощью Amplex Red/Peroxidase и сравнивая различные митохондриальные субстраты и ингибиторы в сапонин-пермеабилизированных нервах, можно было одновременно обнаружить митохондриальные респираторные состояния, активные формы кислорода (АФК) и активность митохондриальных комплексов. Таким образом, метод, представленный здесь, предлагает преимущества по сравнению с оценкой митохондриальной функции другими методами.
Introduction
Митохондрии необходимы для поддержания жизнеспособности клеток и выполняют многочисленные клеточные функции, такие как энергетический метаболизм (пути метаболизма глюкозы, аминокислот, липидов и нуклеотидов). Как основной участок производства активных форм кислорода (АФК), митохондрии занимают центральное место в нескольких клеточных сигнальных процессах, таких как апоптоз, и участвуют в синтезе железо-серных (Fe-S) кластеров, импорте и созревании митохондриального белка и поддержании их генома и рибосом 1,2,3. Сеть динамики митохондриальных мембран контролируется процессами слияния и деления, а также имеет механизм контроля качества и митофагии 4,5,6.
Митохондриальная дисфункция связана с появлением нескольких патологических состояний, таких как рак, диабет и ожирение7. Нарушения митохондриальной функции выявляются при нейродегенеративных расстройствах, влияющих на центральную нервную систему, таких как болезнь Альцгеймера 8,9, болезнь Паркинсона10,11, боковой амиотрофический склероз12,13 и болезнь Хантингтона14,15 . В периферической нервной системе потеря митохондриальной функции в аксонах наблюдается при иммунных невропатиях, таких как синдром Гийена-Барре16,17, и в связи с высокой митохондриальной продукцией АФК в аксонах эти события приводят к активации MAP киназы в шванновских клетках18. Это демонстрирует, что митохондриальная физиология может быть необходима не только для клетки, специфичной для сайта, но и для всей ткани. При ВИЧ-ассоциированной дистальной сенсорной полинейропатии (ВИЧ-ДСП) митохондрии играют роль в механизме, с помощью которого трансактиватор транскрипционного белка (ВИЧ-ТАТ) позволяет ВИЧ эффективно реплицироваться, а также ряд других ролей в патогенезе ВИЧ-инфекции19,20.
Оценка физиологии митохондрий седалищного нерва стала важной целью для исследования нейропатии 7,21,22. При диабетической нейропатии протеомный и метаболомный анализы показывают, что большинство молекулярных изменений при диабете влияют на митохондриальное окислительное фосфорилирование седалищного нерва и липидный обмен7. Эти изменения также, по-видимому, являются ранними признаками диабета21, вызванного ожирением. В мышиной модели вызванной химиотерапией болезненной нейропатии митохондриальные нарушения в седалищном нерве обнаруживаются как снижение окислительного фосфорилирования22 и снижение активности митохондриальных комплексов, мембранного потенциала и содержания АТФ23. Однако, хотя несколько групп ссылались на митохондриальную дисфункцию при невропатиях, эти исследования ограничены измерениями активности в митохондриальных комплексах без сохранения митохондриальных мембран, без оценки целостности митохондрий или измерений содержания АТФ в качестве параметра для митохондриальной продукции АТФ. В целом, правильная оценка потребления митохондриального кислорода и производства АФК требует выделения митохондрий путем дифференциального центрифугирования в градиенте перколл/сахарозы. Выделение митохондрий также может быть ограничивающим фактором для ткани седалищного нерва из-за большого количества необходимой ткани и потери и разрушения митохондрий.
Настоящее исследование направлено на обеспечение протокола для измерения митохондриальной физиологии как потребления митохондриального кислорода и производства АФК в седалищном нерве, сохраняя митохондриальные мембраны и без необходимости выделения митохондрий. Этот протокол адаптирован из измерений потребления кислорода в пермеабилизированных мышечных волокнах24 с помощью респирометрии высокого разрешения (HRR). Преимуществами этой процедуры являются возможность оценки митохондрий в небольших количествах ткани, таких как седалищный нерв, и оценка митохондриальных параметров in situ, тем самым сохраняя митохондриальную среду, структуру и биоэнергетический профиль, для получения физиологически достоверного результата. Митохондриальные респираторные состояния определяли с помощью субстратов и ингибиторов после пермеабилизации седалищного нерва для правильной оценки митохондриальной биоэнергетики и коэффициента цитохрома C для целостности митохондриальной мембраны, обеспечивая руководство для этапов оценки митохондриальной электронной транспортной системы (ETS) и расчета существенных параметров. Это исследование может предоставить инструменты для ответа на вопросы в патофизиологических механизмах, в которых участвует метаболизм седалищного нерва, таких как периферические невропатии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Некоторые заболевания или состояния, сопровождающие невропатии, имеют митохондриальную дисфункцию в качестве фактора риска. Оценка функции митохондрий в периферических нервах имеет важное значение для выяснения того, как митохондрии действуют в этих нейродегенеративных состояниях….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Институтом Серрапилхейры, Фондом организации ампаро в Пескисе по вопросам развития Рио-де-Жанейро (ФАПЕРЖ), Национальным советом по научным вопросам и технологиям (CNPq) и Координационным советом по вопросам образования в Нижнем Бразилии (CAPES). Мы благодарны д-ру Антонио Галине Фильо, д-ру Монике Монтеро Ломели и д-ру Клаудио Масуде за поддержку с лабораторным оборудованием, а также доктору Марте Соренсон за добрые и ценные комментарии по улучшению статьи.
Materials
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. 유전학. 207 (3), 843-871 (2017).
- Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
- Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
- Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
- Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
- Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson’s disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
- Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
- Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
- Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
- Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
- Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and ‘plugging’ of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
- Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
- Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
- Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
- Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, (2019).
- Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
- Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
- Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
- Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , 80 (2014).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
- Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
- Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
- Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
- Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
- Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
- Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
- Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
- Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
- Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).
