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생화학

고해상도 호흡 측정법에 의한 좌골 신경의 미토콘드리아 기능 평가

Published: May 05, 2022
doi:
10.3791/63690
,
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde,Universidade Federal do Rio de Janeiro

Summary

형광 센서에 결합된 고분해능 호흡법은 미토콘드리아 산소 소비량과 반응성 산소 종(ROS) 생성을 결정합니다. 본 프로토콜은 투과화된 좌골 신경에서 미토콘드리아 호흡률 및 ROS 생산을 평가하는 기술을 기술한다.

Abstract

말초 신경의 미토콘드리아 기능 장애는 말초 신경 병증과 관련된 여러 질병을 동반하며,자가 면역 질환, 당뇨병, 감염, 유전 장애 및 종양을 포함한 여러 원인에 의해 유발 될 수 있습니다. 마우스 말초 신경에서 미토콘드리아 기능을 평가하는 것은 작은 표본 크기, 조직에 존재하는 제한된 수의 미토콘드리아, 및 미엘린 외피의 존재로 인해 어려울 수 있습니다. 이 연구에 설명 된 기술은 근육 섬유에 사용되는 것으로부터 적응 된 독특한 투과 프로토콜을 사용하여 미토콘드리아를 조직으로부터 분리하는 대신 좌골 신경 미토콘드리아 기능을 평가함으로써 이러한 도전을 최소화합니다. Amplex Red/Peroxidase로 플루오르 반응성 종 생산을 측정하고 사포닌 투과 신경에서 다른 미토콘드리아 기질과 억제제를 비교함으로써 미토콘드리아 호흡 상태, 반응성 산소 종 (ROS) 및 미토콘드리아 복합체의 활성을 동시에 감지 할 수있었습니다. 따라서, 여기에 제시된 방법은 다른 기술에 의한 미토콘드리아 기능의 평가와 비교하여 이점을 제공한다.

Introduction

미토콘드리아는 세포 생존력을 유지하고 에너지 대사 (포도당, 아미노산, 지질 및 뉴클레오티드 대사 경로)와 같은 수많은 세포 기능을 수행하는 데 필수적입니다. 반응성 산소 종 (ROS) 생산의 주요 부위로서, 미토콘드리아는 아폽토시스와 같은 여러 세포 신호 전달 과정에서 중심이며 철 – 황 (Fe-S) 클러스터의 합성, 미토콘드리아 단백질 수입 및 성숙, 게놈 및 리보솜 1,2,3의 유지에 참여합니다. 미토콘드리아 막 역학 네트워크는 융합 및 분열 과정에 의해 제어되며, 품질 관리 및 미토파지 4,5,6 용 기계도 갖추고 있습니다.

미토콘드리아 기능 장애는 암, 당뇨병 및 비만과 같은 여러 병리학 적 상태의 출현과 관련이 있습니다7. 미토콘드리아 기능의 교란은 알츠하이머 병 8,9, 파킨슨 병10,11, 근위축성 측삭 경화증 12,13 및 헌팅턴 병 14,15에서와 같이 중추 신경계에 영향을 미치는 신경 퇴행성 장애에서 발견됩니다. . 말초 신경계에서, 축색돌기에서의 미토콘드리아 기능의 상실은 길랑-바레 증후군16,17과 같은 면역 신경병증에서 관찰되고, 축색돌기에서의 높은 미토콘드리아 ROS 생산과 관련하여, 이러한 사건은 슈완 세포18에서 MAP 키나제 활성화를 유도한다. 이것은 미토콘드리아 생리학이 부위 특이적 세포뿐만 아니라 전체 조직에 필수적 일 수 있음을 보여줍니다. HIV-관련 원위 감각 다발성 신경병증 (HIV-DSP)에서, 미토콘드리아는 전사의 트랜스-활성화제 (HIV-TAT) 단백질이 HIV가 효율적으로 복제할 수 있게 하는 기작에서 역할을 할 뿐만 아니라, HIV 감염 병인에서 몇 가지 다른 역할도한다 19,20.

좌골 신경 미토콘드리아 생리학의 평가는 신경병증 7,21,22를 조사하기 위한 필수적인 표적으로서 등장하였다. 당뇨병성 신경병증에서, 프로테오믹 및 대사체 분석은 당뇨병의 대부분의 분자 변화가 좌골 신경 미토콘드리아 산화 인산화 및 지질 대사에 영향을 미친다는 것을 시사한다7. 이러한 변화는 또한 비만으로 인한 당뇨병21의 초기 징후 인 것으로 보입니다. 화학요법-유도된 통증성 신경병증의 마우스 모델에서, 좌골 신경의 미토콘드리아 손상은 산화적 인산화(22)의 감소, 및 미토콘드리아 복합체 활성, 막 전위, 및 ATP 함량(23)의 감소로서 검출된다. 그러나 여러 그룹이 신경 병증에서 미토콘드리아 기능 장애를 언급했지만, 이러한 연구는 미토콘드리아 막의 보존이없는 미토콘드리아 복합체에서의 활성 측정으로 제한되며, 미토콘드리아 무결성에 대한 평가가 부족하거나 미토콘드리아 ATP 생산을위한 매개 변수로서 ATP 함량의 측정이 부족합니다. 일반적으로 미토콘드리아 산소 소비량과 ROS 생산에 대한 적절한 평가는 퍼콜/수크로오스 구배에서 차등 원심분리에 의한 미토콘드리아의 분리를 필요로 합니다. 미토콘드리아의 분리는 또한 다량의 조직이 필요하고 미토콘드리아의 손실 및 파괴로 인해 좌골 신경 조직에 대한 제한 요소가 될 수 있습니다.

본 연구는 좌골 신경에서 미토콘드리아 산소 소비 및 ROS 생산으로 미토콘드리아 생리학을 측정하여 미토콘드리아 막을 보존하고 미토콘드리아를 분리 할 필요없이 미토콘드리아 생리학을 측정하는 프로토콜을 제공하는 것을 목표로합니다. 이 프로토콜은 고분해능 호흡측정법(HRR)에 의해 투과된 근섬유(24 )에서의 산소 소비 측정으로부터 적응된다. 이 절차의 장점은 좌골 신경과 같은 소량의 조직에서 미토콘드리아를 평가하고 현장에서 미토콘드 리아 매개 변수를 평가하여 미토콘드리아 환경, 구조 및 생물 에너지 프로파일을 보존하여 생리적으로 신뢰할 수있는 결과를 얻을 수 있다는 것입니다. 미토콘드리아 호흡 상태는 좌골 신경 투과 후 기질 및 억제제로 결정되어 미토콘드리아 막 완전성에 대한 미토콘드리아 생물 에너지 및 시토크롬 c 계수를 적절하게 평가하여 미토콘드리아 전자 수송 시스템 (ETS) 평가 및 필수 매개 변수 계산의 단계에 대한 가이드를 제공했습니다. 이 연구는 좌골 신경 대사가 수반되는 병리 생리학 적 메커니즘의 질문에 대답하기위한 도구를 제공 할 수 있습니다 (예 : 말초 신경 병증).

Protocol

본 프로토콜은 연구에서 동물 사용에 관한 윤리위원회, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침에 의해 승인되었습니다. 좌골 신경은 4 개월 된 수컷 C57BL / 6 마우스에서 분리되며, 기관 지침에 따라 자궁 경부 탈구에 의해 안락사됩니다. 프로토콜 단계는 미토콘드리아 악화를 피하기 위해 최적화되어 있습니다. 따라서, 이 프로토콜에서, 편광 산소 센서의 교정은 마…

Representative Results

투과된 좌골 신경에 의한 미토콘드리아 산소 소비량은 도 2에 나타내었다. 적색 트레이스는 단위 질량당O2 플럭스를 pmol/s.mg로 나타낸다. 내인성 기질로 기저 산소 소비를 기록한 후(일상적인 호흡), 숙시네이트(SUCC)는 콤플렉스 II(숙시네이트 데하이드로게나제)-구동 호흡을 기록하기 위해 주입되어, 산소 소모율의 증가를 초래한다. 순차적으로, ADP의 포화 농도가 첨?…

Discussion

신경 병증을 동반하는 여러 질병 또는 상태는 위험 인자로서 미토콘드리아 기능 장애를 갖는다. 말초 신경에서 미토콘드리아 기능의 평가는 미토콘드리아가 이러한 신경 퇴행성 조건에서 어떻게 작용하는지 밝히는 데 필수적입니다. 미토콘드리아 기능의 평가는 분리 방법의 어려움과 물질의 부족으로 인해 힘들다. 따라서, 미토콘드리아의 단리를 필요로 하지 않는 조직 투과화 기술의 개발이 필…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) 및 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)에 의해 자금을 지원받았다. 우리는 안토니오 갈리나 필로 박사, 모니카 몬테로 로멜리 박사와 클라우디오 마수다 박사에게 실험실 시설에 대한 지원과 마사 소렌슨 박사에게 기사 개선에 친절하고 가치있는 의견을 주신 것에 감사드립니다.

Materials

Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate Sigma-Aldrich A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Amplex Red Reagent Thermo Fisher scientific A12222 Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.) Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030 heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752 (from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91 OROBOROS INSTRUMENTS, Austria Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V Thermo Fisher scientific 88882005
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
EGTA sodium salt Sigma-Aldrich E8145
Hamilton syringe Sigma-Aldrich HAM80075 10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W Merck H1009
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
Micro-dissecting forceps, curved Sigma-Aldrich F4142
Micro-dissecting forceps, straight Sigma-Aldrich F4017
O2K – Filter set Amplex Red OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44321-01 Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44210-01
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k OROBOROS INSTRUMENTS, Austria http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) Sigma-Aldrich P4509
Peroxidase from horseradish Sigma-Aldrich P8375
Petri dishes, polystyrene MERCK P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic Sigma-Aldrich PHR1330
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich SAE0073
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Taurine Sigma-Aldrich T0625
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References

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Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira, J. Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (183), e63690, doi:10.3791/63690 (2022).
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