Summary
Her beskriver vi en metode til at generere glioblastom (GBM) organoider fra primære patientprøver eller patientafledte cellekulturer og opretholde dem til modenhed. Disse GBM-organoider indeholder fænotypisk forskellige cellepopulationer og genskaber tumormikromiljøer ex vivo.
Abstract
Glioblastom (GBM) er den mest almindeligt forekommende primære maligne hjernekræft med en ekstremt dårlig prognose. Intratumoral cellulær og molekylær mangfoldighed samt komplekse interaktioner mellem tumormikromiljøer kan gøre det til en udfordring at finde effektive behandlinger. Traditionelle klæbende eller kuglekulturmetoder kan maskere sådanne kompleksiteter, mens tredimensionel organoidkultur kan rekapitulere regionale mikromiljøgradienter. Organoider er en metode til tredimensionel GBM-kultur, der bedre efterligner patienttumorarkitektur, indeholder fænotypisk forskellige cellepopulationer og kan bruges til eksperimenter med medium gennemstrømning. Selvom tredimensionel organoidkultur er mere besværlig og tidskrævende sammenlignet med traditionel kultur, giver den unikke fordele og kan tjene til at bygge bro over kløften mellem nuværende in vitro- og in vivo-systemer . Organoider har etableret sig som uvurderlige værktøjer i arsenalet af kræftbiologer for bedre at forstå tumoradfærd og resistensmekanismer, og deres applikationer fortsætter kun med at vokse. Her gives detaljer om metoder til generering og vedligeholdelse af GBM-organoider. Instruktioner om, hvordan man udfører organoid prøveindlejring og sektionering ved hjælp af både frosne og paraffinindlejringsteknikker samt anbefalinger til immunohistokemi og immunfluorescensprotokoller på organoidsektioner og måling af total organoidcellelevedygtighed er alle også beskrevet.
Introduction
Glioblastom (GBM) er den mest almindeligt forekommende primære hjernetumor med en dyster prognose på ca. 15 måneder fra diagnose1. Behandlinger, der er effektive i prækliniske undersøgelser, kan ofte være dårligt effektive hos patienter 2,3. Dårlig klinisk respons tilskrives mange faktorer, herunder den mikromiljømæssige heterogenitet af GBM og komplekse intratumorale interaktioner. Disse kan være vanskelige at genskabe i laboratoriemiljøet med traditionelle klæbe- eller kuglekulturmetoder4. Tilstedeværelsen af en delmængde af selvfornyende kræftstamceller (CSC'er) inden for GBM kan også bidrage til denne kompleksitet 5,6. CSC'er er afgørende for tumorudbredelse og opretholder tumorvækst ved at fremme aktiv angiogenese, kræftinvasion og resistens over for terapier, herunder stråling 7,8,9. CSC'er er ikke ensartet fordelt gennem tumorer, men er snarere beriget inden for specifikke mikromiljøer, herunder den perivaskulære niche og perinekrotiske regioner, som hver især giver særskilt molekylær regulering af deres cellulære tilstande 10,11,12,13,14. CSC'er er ikke passive modtagere af mikromiljømæssige signaler, men har i stedet evnen til at ombygge deres egne mikromiljøer 7,15,16. Mikromiljøet i en CSC kan fremme vedligeholdelse af stamcelletilstand som reaktion på tryk som næringsstofknaphed, pH og hypoxi17,18,19,20, hvilket tyder på vigtigheden af disse forhold i et modelsystem. Rekapitulation af det forskellige cellulære mikromiljø inden for tumorer er derfor afgørende for at forstå terapeutisk resistens og identificere nye terapier.
Tredimensionel kultur er steget i popularitet i de senere år21,22. Organoider er blevet brugt i andre former for kræft, og det primære mål med at opretholde celler som organoider er at muliggøre vækst af heterogene cellepopulationer (hvoraf mange normalt kan udkonkurreres i mere homogen kuglekultur) og rumlig mangfoldighed, set som regionale tumormikromiljøer med genetisk specificitet 4,23,24,25,26 . Der er mange metoder til tredimensionel kultur af kræftceller, som hver har fordele og ulemper27,28,29. Organoidkultur er ikke beregnet til at være en erstatning for traditionel tilhænger- eller kuglekultur. Det bruges bedst som en komplementær teknik til todimensionelle metoder, når der er specifikke spørgsmål, hvor interaktionen mellem cellemikromiljø og tumorcelleresponser er kritisk.
Denne artikel beskriver pålidelige og gentagelige metoder til at generere GBM-organoider fra enten primære patientprøver eller patientafledte kulturer. Vi adresserer to forskellige mål for tredimensionel organoidkultur: (1) etablering af organoider fra primært patientvæv med maksimalt engraftmentpotentiale uanset ensartethed eller (2) dyrkning af ensartede organoider til mere kvantitativ eksperimentel brug. Ved etablering af en primærprøve som organoider er det ikke nødvendigt at filtrere efter enkeltceller eller tælle celler, fordi det er en prioritet at holde maksimale cellenumre og typer for at etablere den oprindelige kultur. Ved dyrkning af organoider til sammenlignende eksperimenter er der imidlertid behov for enkeltcellefiltrering og celletælling for at sikre, at replikatorganoider er sammenlignelige for eksperimentel konsistens. Denne protokol beskriver, hvordan man etablerer organoidkulturer og skaber ensartede organoider samt raffinerede metoder til indlejring og konservering af organoider og standardcellekultureksperimenter, herunder immunohistokemi, immunfluorescens og vurdering af total cellelevedygtighed i GBM-organoider.
Protocol
Alle trin i protokollen (e), der er beskrevet nedenfor, blev udviklet og udført i overensstemmelse med Cleveland Clinic Institutional Review Board (IRB) protokol # 2559 og Institutional Biosafety Committee (IBC) godkendelse # 1711. Kugler og organoider dyrkes i "Neurobasal Media Complete" (NBMc). Se vejledning i tabel 1 .
1. Fremstilling af organoidforme
- Tag vokspapiret af parafilmpladen (ca. 4 cm x 4 cm i størrelse) og læg det mellem to sterile 96-brønds polymerasekædereaktionsplader (PCR).
- Udfør disse trin i kulturhætten og vær særlig omhyggelig med at holde "indersiden" af parafilmen (den side, der er dækket af papiret) ren. Denne rene side skal gøre konkavitet af indrykningerne.
- Påfør jævnt tryk på den øverste 96-brønds PCR-plade for at danne små fordybninger i parafilmen. Målet er at få fordybninger til at være ca. 2 mm dybe uden at skabe huller i parafilmen.
- Adskil de to 96-brønds PCR-plader forsigtigt. Den dimpled parafilm klæber til toppladen. Placer dette på tøris i ca. 30 s.
- Når parafilmen har været på tøris i 30 sekunder, skal du bruge steril tang til at trække parafilmen af den øverste 96-brønds PCR-plade.
- Når du fjerner parafilmen, skal du bruge en hurtig bevægelse i stedet for at være meget "forsigtig". Frossen parafilm er lettere at fjerne end opvarmet parafilm, hvilket kan få fordybningerne til at vende om.
- Anbring den færdige parafilmform i en tildækket, steril 10 cm cellekulturskål. Forme kan fremstilles på forhånd og opbevares, hvis steriliteten opretholdes.
2. Makrodissektion af patientens vævsprøve
- I en steril dyrkningsskål (10 cm cellekulturplader) skal du bruge to sterile barberblade til fint at hakke patientprøven, mens du anvender jævnt tryk.
BEMÆRK: Hakning af prøven er nemmest med ca. 500 μL NBMc på kulturskålen. Forsøg med barberblade at hakke stykker så fint som muligt; Ideelt set er individuelle stykker 1 mm3 eller mindre. - Overfør de fint hakkede tumorstykker til et 15 ml centrifugerør ved hjælp af en skåret p1000 pipettespids.
BEMÆRK: Når du håndterer organoider, er det vigtigt kun at bruge afskårne p1000 pipettespidser. Disse kan skæres ved hjælp af en skarp barbermaskine til ønsket åbningsstørrelse (mellem 5 og 8 mm groft) og autoklaveres. - Tilsæt 2 ml rumtemperatur (RT) celleløsrivelsesopløsning (materialetabel) og anbring den i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i ca. 10 min.
BEMÆRK: Overhold og bland hvert par minutter. Nogle celleløsningsopløsninger eller prøver kan have brug for varierende inkubationstider. Hvis der vises klumpning, hvilket kan indikere DNA-frigivelse på grund af cellelyse, skal du straks fortsætte til næste trin. - Tilsæt 8 ml NBMc-medier for at neutralisere celleopløsningen, og drej i 3 minutter ved 65 x g.
- Aspirer supernatanten og resuspenderer vævet i 1-2 ml NBMc.
3. Generering af organoider fra primært patientvæv
BEMÆRK: Målet ved fremstilling af organoider fra primært patientvæv er at etablere tredimensionel kultur. Filtrer ikke efter enkeltceller eller tælleceller, men hold den oprindelige cellebelastning så ensartet som muligt ved hjælp af visuel inspektion. Det er normalt at have heterogenitet i vækst og etablering af indledende organoider. Hver organoid vil være 20 μL i volumen (16 μL lamininrig ekstracellulær matrix (lrECM) og 4 μL væv suspenderet i NBMc, fra trin 2.5). Instruktioner kan justeres for antallet af tilsigtede organoider; Målet er typisk at danne omkring 20-30 organoider fra primære patientprøver.
- I en isspand eller kold blok anbringes lrECM og et lille centrifugerør. Den passende mængde lrECM (16 μL x X antal tilsigtede organoider) anbringes i det lille centrifugerør.
- Der tilsættes et passende volumen vævssuspension fra trin 2.5 (4 μL x antal tilsigtede organoider) til centrifugerøret på is.
- Der pipetteres forsigtigt 20 μL af lrECM/cellesuspensionsblandingen på parafilmforme; Dette vil danne en perlelignende dråbe.
- Sørg for at blande lrECM/cellesuspensionsblandingen grundigt; cellerne har tendens til at bosætte sig let inden for lrECM, hvilket resulterer i heterogene organoider.
- Opbevar lrECM/cellesuspensionsblandingen på is. Hvis lrECM opvarmes, kan det polymerisere og kompromittere organoiddannelsen. Sørg for at afkøle pipettespidsen hver anden til tre organoider for at forhindre lrECM-polymerisation. Indfør ikke luftbobler i organoider (undgå at "dobbeltskubbe" pipetten).
- Når det ønskede antal organoider er pipetteret på parafilmform i en 10 cm cellekulturplade, dækkes med pladelåg og inkuberes i en cellekulturinkubator ved 37 °C, 5% CO 2 i1-2 timer.
- Når organoiderne er størknet, skal du bruge NBMc-medier til at skylle dem forsigtigt af parafilmformen og ind i en ny, steril 10 cm kulturplade med 20 ml NBMc i alt. Brug af en p1000 tip fungerer bedst til at skylle organoiderne af formen; de glider forsigtigt af.
BEMÆRK: Når organoider skylles fra formene til cellekulturplader, skal de være synlige i medierne som små lyserøde kugler. Hvis organoiderne ser ud til at være faldet fra hinanden eller knust i medierne, indikerer dette et tidligere problem med lrECM, der er polymeriseret, og organoider kan stadig vokse, men det vil være meget usandsynligt, at de er ensartede i størrelse. - Dyrkningsskålen på 10 cm anbringes i en cellekulturkuvøse ved 37 °C, 5 % CO2 (uden omrystning) i 4 dage.
BEMÆRK: Placering af organoider på en orbital shaker i de første dage kan få dem til at falde fra hinanden. Sørg for, at de ikke ryster før dag 4. - Efter 4 dage udveksles mediet, og der anbringes en orbital shaker ved 80 RPM i en cellekulturinkubator ved 37 °C, 5% CO2.
- Udveksling af medier med umodne organoider er udfordrende, fordi de er vanskelige at visualisere. Vip cellekulturskålen og vent i mindst 20 s; organoiderne vil sætte sig i bunden og tillade, at mediet ovenfra fjernes med en glas eller plast 10-20 ml pipette langsomt.
- Vær opmærksom på samlingen af organoider i bunden; Hvis de ser ud til at være rørt op med kraften fra mediefjernelse, er det bedst at stoppe og lade dem genbosætte. Efterhånden som organoider modnes og er lettere at visualisere, bliver denne proces mindre nuanceret.
BEMÆRK: Nogle gange kan placering af et stykke mørkt papir under cellekulturpladen hjælpe med at visualisere umodne organoider. Det tilrådes ikke at bruge en Pasteur-pipette med vakuumsug til at fjerne medier, da det er meget let for organoiderne at blive suget op og tabt på denne måde. - Når organoider først etableres, forbruger de ikke medier så hurtigt som modne organoider. Begyndende med 50% medieudveksling reducerer unødvendig mediebrug og reducerer risikoen for ved et uheld at beskadige eller aspirere nye organoider under medieudvekslingsprocessen.
4. Generering af organoider fra etableret GBM-sfære, tilhænger eller organoidkultur
BEMÆRK: Målet her er at fremstille organoider, der er ensartede i størrelse og cellemængde til brug i sammenlignende eksperimenter, så brug et enkeltcellefilter og tæl celler for at sikre dette.
- Forberedelse af enkeltcellesuspension fra GBM-kuglekultur.
BEMÆRK: Kuglekulturer af GBM-celler opretholdes i NBMc-medier.- Placer kugler i et 15 ml centrifugerør og drej ved 120 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og tilsæt 2 ml RT-celleopløsning. Anbring i en 37 °C inkubator i 3 min.
- Tilsæt 8 ml NBMc-medier for at neutralisere celleløsningen. Sil gennem en enkeltcelle sil (70 μm) og drej i 5 minutter ved 120 x g.
- Fjern supernatanten fra røret og suspender de resterende celler i ~ 1 ml NBMc. Tæl cellerne (ved hjælp af celle impermeant plet) og spring til trin 4.4.
- Forberedelse af enkeltcellesuspension fra GBM-klæbende kultur.
- Fjern det brugte medie fra pladen, tilsæt 2 ml RT-celleløsrivelsesopløsning til pladen, og anbring i en 37 °C inkubator i 3 min.
- Bekræft under mikroskopet, at cellerne er løsrevet fra pladen.
- Tilsæt 8 ml NBMc-medier for at neutralisere celleløsrivelsesopløsning. Belastning gennem en enkeltcellet sil (70 μm).
BEMÆRK: Enkeltcellespænding er valgfri, når du arbejder med tilhængerkultur. - Spin i 5 min ved 120 x g. Fjern supernatanten fra røret og suspender de resterende celler i ~ 1 ml NBMc. Tæl cellerne (ved hjælp af celle impermeant plet) og spring til trin 4.4.
- Forberedelse af enkeltcellesuspension fra GBM organoidkultur.
- Overfør organoiderne ved hjælp af en skåret p1000 pipettespids til en 10 cm kulturplade, og fjern forsigtigt så mange resterende medier som muligt.
- Brug to sterile barbermaskiner forsigtigt hakket organoider fint. Med den skårne p1000-spids flyttes de hakkede organoider til et 15 ml centrifugerør og tilsættes ~ 2-3 ml NBMc-medier.
- Drej ved 120 x g i 3 minutter, og fjern supernatanten (anbefal at bruge en pipettespids i stedet for vakuumsugning til denne del).
- Tilsæt 2 ml koldcelleløsningsopløsning i 10 min.
BEMÆRK: Celleopløsningen skal anvendes direkte fra 4 °C og opvarmes ikke først. Dette ser ud til at blødgøre eventuelle resterende matrigel og hjælper med cellegendannelse. - Flyt derefter til en 37 ° C inkubator i 10-20 min, observer og bland hvert par minutter. Hvis der vises klumpning, hvilket kan indikere cellelysis, skal du straks fortsætte til næste trin.
- Tilsæt 8 ml NBMc-medier for at fortynde celleopløsningen. Sil gennem en enkeltcellet sil (70 μm) og drej i 5 minutter ved 120 x g.
- Fjern supernatanten fra røret, og suspender de resterende celler i ~ 1 ml NBMc. Tæl cellerne (ved hjælp af celleimpermeant plet) og fortsæt til trin 4.4.
- Fremstilling af organoider fra en enkeltcellesuspension
- I en isspand eller kold blok anbringes lrECM og et lille centrifugerør. Den passende mængde lrECM (16 μL x X antal tilsigtede organoider) anbringes i det lille centrifugerør.
- Opret en blanding af celler i et samlet volumen (4 μL x X antal tilsigtede organoider), der vil indeholde 20.000 celler / organoid, og tilsæt dette til det lille centrifugerør med lrECM på is.
- Der pipetteres forsigtigt 20 μL af lrECM/cellesuspensionsblandingen på parafilmforme; Dette vil danne en perlelignende dråbe.
- Sørg for at blande lrECM / cellesuspensionsblandingen grundigt, da cellerne har tendens til at sætte sig let inden for lrECM, og dette vil resultere i heterogene organoider.
- Opbevar lrECM/cellesuspensionsblandingen på is. Hvis lrECM opvarmes, kan det polymerisere og kompromittere organoiddannelsen.
- Sørg for at afkøle pipettespidsen hver anden til tre organoider for at forhindre lrECM-polymerisation. Indfør ikke luftbobler i organoider (undgå at "dobbeltskubbe" pipettespidsen).
- Når det ønskede antal organoider er pipetteret på parafilmform i en 10 cm kulturplade, inkuberes ved 37 ° C i 1-2 timer i en cellekulturinkubator.
- Når organoider er størknet, skal du bruge NBMc-medier til at skylle dem forsigtigt af parafilmformen og ind i en ny, steril 10 cm kulturplade med 20 ml NBMc i alt. Brug af en p1000 tip fungerer bedst til at skylle organoider ud af formen; de glider forsigtigt af.
BEMÆRK: Ca. 15-20 organoider pr. 10 cm kulturskål anbefales. - Placer 10 cm kulturskålen i en inkubator (uden omrystning) i 4 dage.
- Efter 4 dage udveksles mediet og placeres på en orbital shaker ved 80 o / min i cellekulturinkubatoren. Udveksle medier hver 2-3 dage derefter.
- Udveksling af medier med umodne organoider er udfordrende, fordi de er vanskelige at visualisere. Vip cellekulturskålen og vent i mindst 20 s; Organoiderne vil sætte sig i bunden og lade mediet ovenfra fjernes med en stor glaspipette langsomt.
- Vær opmærksom på samlingen af organoider i bunden; Hvis de ser ud til at være ophidsede med mediefjernelsens kraft, skal du stoppe op og lade dem genbosætte. Efterhånden som organoider modnes og er lettere at visualisere, bliver denne proces mindre nuanceret.
BEMÆRK: Nogle gange kan placering af et stykke mørkt papir under cellekulturpladen hjælpe med at visualisere umodne organoider. Brug ikke en Pasteur-pipette med vakuumsug til at fjerne medier, da det er meget let for organoiderne at blive suget op og tabt på denne måde. - Når organoider først etableres, forbruger de ikke medier så hurtigt som modne organoider. Begynd med 50% medieudvekslinger for at reducere unødvendig mediebrug og reducere risikoen for ved et uheld at beskadige eller aspirere nye organoider under medieudvekslingsprocessen.
5. Cryoembedding
- Hver organoid placeres i et individuelt 1,5 ml rør (ved hjælp af skåret p1000 spids) indeholdende 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA). Opbevar organoider natten over ved 4 °C. Hvis organoider indlejres i paraffin, fortsættes til punkt 6.
- Efter fiksering natten over i 4% PFA vaskes organoiderne i 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) tre gange.
- Organoiden overføres til et nyt 1,5 ml rør (ved hjælp af skåret p1000 pipettespids), der indeholder 1 ml 30% saccharose i vand, og opbevares ved 4 °C natten over.
- Tilsæt en lille mængde (typisk 1-2 ml) optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) til en cryomold, der dækker bunden og fylder ca. 1/3 til 1/2 af formens dybde.
- Overfør en enkelt organoid til cryomold ved hjælp af skåret p1000 pipettespids. Dette vil resultere i, at nogle medier overføres med organoiden, hvilket er uundgåeligt. Brug en mindre pipettespids til forsigtigt at fjerne omgivende medier uden at forstyrre organoiden.
BEMÆRK: Dette kan være svært at visualisere, men langsom pipettering vil demonstrere en klar forskel i tætheder mellem medier og OCT, så dette gøres "ved følelse" til en vis grad). - Læg cryomolden på en bakke med tøris. OCT begynder at fryse og bliver uigennemsigtig i processen.
- Tilsæt yderligere OCT for helt at dække organoiden og fylde resten af cryomoldens volumen. Blokke kan opbevares ved -20 °C til kortvarig opbevaring i flere dage eller ved -80 °C til langtidsopbevaring på ubestemt tid.
6. Paraffin indlejring
- Sorter organoider efter størrelse (små organoider er under 3 mm, store organoider er over 3 mm). Hver organoid overføres til en histologisk kassette ved hjælp af en skåret p1000-pipettespids, og der forarbejdes til paraffinvoks i henhold til enten tabel 2 eller tabel 3.
BEMÆRK: Størrelsen/konfigurationen af histologikassetten er op til brugeren. - Overfør organoider fra kassetterne til indlejringsforme med 1-2 ml smeltet paraffinvoks og afkøl det, indtil voksen er halvfast.
- Når voksen er delvist størknet, tilsættes mere voks til toppen af formen. Placer den mærkede kassetteplade over formen, og overfør denne til en kold plade. Fortsæt afkøling, indtil voksen er helt fast.
- Når voksen er størknet, skal du sektionere blokken ved hjælp af et mikrotom. Alternativt kan du opbevare ved RT eller 4 °C til senere sektionering.
7. Immunfluorescens (IF)
- De-paraffiniser og rehydrer 5-12 μm paraffinindlejrede vævssektioner ved hjælp af en diasfarvningsskål i henhold til følgende trin.
BEMÆRK: Hvis du bruger sektioner fra OCT-indlejrede organoider, anbefaler vi at bruge 12 μm sektioner. Fjern OCT ved at ryste slide i PBS i 30 min. Gå til trin 7.2.- Inkuberes i 5 minutter i xylen. Gentag dette to gange mere. Derefter inkuberes i 10 minutter i 100% ethanol. Gentag dette endnu en gang.
- Inkuberes i 10 min i 95% ethanol. Gentag endnu en gang. Vask sektionerne i destilleret vand i 5 minutter, to gange.
- Til demaskering af antigen nedsænkes dias i 1x citrat demaskeringsopløsning (materialetabel) og mikrobølgeovn ved subkogetemperatur i 10 min. Sørg for ikke at lade opløsningen koge.
BEMÆRK: Dette opnås bedst, hvis det først mikrobølges i ~ 2 minutter, indtil kogning opstår, derefter sænkes strømmen og ser for at sikre, at opløsningen ikke koger over. Den foretrukne afdækningstemperatur er lige under 100 °C, ideelt set 98 °C. - Lad diasene køle af i 30 minutter ved RT i 1x citrat-demaskeringsopløsningen.
BEMÆRK: Dette er den samme 1x citratopløsning; Løsningen behøver ikke udskiftes på dette trin. - Vask rutsjebanerne i destilleret vand i 5 min, to gange.
- Vask diasene i 1x TBST (Tris-buffered saltvand med 0,1% Tween 20) buffer i 5 min.
- Fjern diasene fra TBST, og tør dem forsigtigt omkring vævssektioner ved hjælp af en laboratorierengøringsserviet, mens du er forsigtig med ikke at lade vævssektionen tørre. Når diaset er tilstrækkeligt tørt, cirkel vævssektioner med en hydrofob barrierepen.
- Bloker hver sektion med 100-400 μL 10% serumblokerende opløsning i 1 time ved RT. Vælg serumblokerende opløsning baseret på det sekundære antistof. For eksempel, hvis du bruger et sekundært antistof fremstillet i æsel, skal du bruge et 10% normalt æselserum i 1x TBST.
- Blokeringsopløsningen fjernes, og der tilsættes derefter 100-400 μL primært antistof fortyndet til den ønskede koncentration i blokeringsopløsningen.
- Ved 4 °C inkuberes sektionerne med det primære antistof natten over.
- Fjern den primære antistofopløsning og vask diasene i 1x TBST i 5 minutter, tre gange.
- Der tilsættes 100-400 μL sekundært antistof (1:1000 fortynding i blokerende opløsning eller i henhold til producentens anvisninger) til hver sektion og inkuberes i 1,5 time ved RT.
- Vask diasene i 1x TBST i 5 min, to gange. Vask derefter diasene i 1x PBS i 5 min.
- Fjern diasene fra PBS og tør dem omkring vævssektioner ved hjælp af en laboratorierengøringsserviet. Tilsæt et par dråber flydende hærdende monteringsbeslag og monter en glasdæksel forsigtigt. Når lysbillederne er tørre, opbevares de ved -20 °C beskyttet mod lys, indtil de er klar til billeddannelse.
8. Immunohistokemi
- De-paraffinize og rehydrere de paraffin-indlejrede vævssektioner ved hjælp af en diasfarvningsskål i henhold til følgende trin.
BEMÆRK: Hvis du bruger sektioner fra OCT-indlejrede organoider, skal du fjerne OCT ved at ryste diaset i PBS i 30 minutter. Gå til trin 8.2.- Inkuberes i 5 minutter i xylen. Gentag to gange mere.
- Inkuberes i 10 min i 100% ethanol. Gentag endnu en gang.
- Inkuberes i 10 min i 95% ethanol. Gentag endnu en gang.
- Vask sektioner i destilleret vand i 5 min, to gange.
- Til demaskering af antigen nedsænkes i 1x citrat demaskeringsopløsning og mikrobølgeovn ved subkogetemperatur i 10 min. Sørg for ikke at lade opløsningen koge.
- Lad slides køle af i 30 minutter ved RT i 1x citrat demaskeringsopløsningen.
- Vask rutsjebanerne i 5 minutter i destilleret vand, tre gange.
- Inkuber diasene i 10 minutter i 3% hydrogenperoxid.
- Vask rutsjebanerne i 5 minutter i destilleret vand to gange.
- Vask diasene i 5 min i 1x TBST.
- Fjern diasene fra 1x TBST, og brug derefter hjørnet af en laboratorierengøringsserviet til forsigtigt at tørre omkring vævssektioner.
- Cirkel vævssektionerne med en hydrofob barrierepen, når diaset er tørt.
- Der anbringes 100-400 μL af blokeringsopløsningen på hver sektion i den hydrofobe barrierepennecirkel ved RT i 1 time. Brug enten 10% normalt æselserum (NDS) eller 0,75% bovin serumalbumin (BSA) fortyndet i 1x TBST.
- Fjern derefter blokeringsopløsningen og tilsæt 100-400 μL af det primære antistof til hvert afsnit. Fortynd dette primære antistof til den ønskede koncentration ved hjælp af den relevante producents fortyndingsmiddel.
- Inkuber sektionerne ved 4 °C natten over. Fjern den primære antistofopløsning og vask diasene i 1x TBST i 5 minutter, tre gange.
- Tilsæt 100-400 μL IHC-detektionsreagens til hver sektion og inkuber i 1 time ved RT. Vælg IHC-detektionsreagenset i henhold til det primære antistof.
- Vask hver sektion med 1x TBST i 5 min, to gange, efterfulgt af 1x PBS i 5 minutter én gang.
- Der fremstilles 3,3-diaminobenzidin (DAB) opløsning i henhold til producentens anvisninger. Tilsæt 100-400 μL DAB-opløsning til hver vævssektion og overvåg nøje under et mikroskop. Mellem 1-10 minutter giver acceptabel farvningsintensitet; Sørg for at notere denne gang og holde konsekvent for alle vævsafsnit.
- Når den ønskede farvningsintensitet er nået, nedsænkes diasene i destilleret vand.
- Udfør hæmatoxylin modfarve og dias dehydrering til montering i henhold til instruktionerne i tabel 4.
- Fjern diaset fra xylenerstatningen (Materialetabel), og tør ekstra væske af omkring vævssektionen ved hjælp af en laboratorierengøringsserviet. Brug en lille mængde permanent monteringsmedium til at montere dæksel over vævssektion og lad det tørre.
9. Måling af den samlede cellelevedygtighed
- Hver organoid overføres til et 2 ml rør, og ved hjælp af en lille pipettespids fjernes alle overskydende medier omkring organoiden forsigtigt (se figur 3 for skematisk for denne procedure).
BEMÆRK: Cellelevedygtighedsassays skal udføres med organoider, der blev lavet med identiske antal celler. Dette eksperiment bør ikke udføres på organoider fremstillet direkte fra patientprøver fra kirurgi, fra skæring af alredy dannede organoider eller andre tilfælde, hvor enkeltceller ikke blev filtreret og talt. - Forbered den selvlysende celle levedygtighedsassay reagens og 1x PBS i 1: 1 forhold og tilsæt 500 μL til hvert rør.
- Brug en p1000 pipettespids til aggressivt at pipettere op og ned for at nedbryde organoiden og lad den sidde i 5 min. Organoiden bør være noget dissocieret og blødere nu; Gentag blandingen med P1000-pipettespidsen igen.
- Målet er at have 100 μL samlet volumen pr. brønd af en 96-brøndplade. Der tilsættes 25 μL af blandingen fra trin 9.3 (vil have nok til flere tekniske replikater) og tilsæt 75 μL resterende selvlysende cellelevedygtighedsassay og PBS-blanding.
- Læg pladen på en ryster i 2 minutter og inkuber derefter i 20 minutter ved RT.
- Pladen aflæses ved hjælp af en luminescensindstilling på en pladelæser, og data indsamles (se figur 4).
Representative Results
Figur 1 viser tidlig organoidvækst set via lysmikroskopi ved 10x forstørrelse. Figur 1A viser migration og invasion af enkeltceller gennem lrECM i midtervisningen. Cellerne vil fortsætte med at udvide og 'kolonisere' lrECM, og de vil fremstå mere tætte og til sidst uigennemsigtige ved visuel inspektion. Figur 1B viser flere modne organoider (efter 7 uger) uden forstørrelse i forhold til størrelsen af en krone.
Figur 2 viser immunohistokemisk farvning af GBM-organoider til phospho-histon H3, en markør for aktiv proliferation. De fleste stærkt proliferative celler ses i organoidomkredsen sammenlignet med organoidkernen. Positiv farvning vil have et brunt / kobber udseende.
Figur 3 beskriver processen til homogenisering og måling af det samlede celleantal i GBM-organoider ved hjælp af et 3D-specifikt selvlysende cellelevedygtighedsassay. På grund af det store antal celler, der er til stede i GBM-organoider, homogeniseres den større organoidstruktur oprindeligt ved triturering i selvlysende assayreagens. Derefter lægges fraktioner af det samlede organoidlysat i individuelle brønde og fortyndes med yderligere selvlysende assayreagens inden inkubation og aflæsning på en passende pladelæser med flere brønde.
Figur 4 viser DMSO-kontroldata (common vehicle) for organoider. Afbildede data viser intraorganoid og interorganoid konsistens. Selvlysende levedygtighedsdata vil typisk blive normaliseret til kontroller for hver prøve, når der genereres eksperimentelle data.
Figur 1: Se gennem et lysmikroskop (10x). (A) Tidlig organoidvækst, der viser migration / invasion af GBM-celler i hele den lamininrige ekstracellulære matrix. (B) Modne organoider i forhold til størrelsen af en krone. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Immunohistokemi af GBM-organoider. (A, B) GBM-organoider, der viser phospho-histon H3-farvede celler til aktiv proliferation. Scalebars er 600 μm og 300 μm for henholdsvis A og B. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Selvlysende cellelevedygtighedsprotokol for organoider. (A) Flyt individuelle organoider til små centrifugerør, og fjern overskydende medier. (B) Tilsæt 500 μL 1:1 PBS og selvlysende cellelevedygtighedsassayblanding til hvert rør og pipetter aggressivt for at nedbryde organoiden. (C) Tilsæt 25 μL af denne organoidblanding og 75 μL af den samme 1:1 PBS- og selvlysende cellelevedygtighedsassayblanding til hver brønd i en 96-brøndsplade. (D) Anbring på en ryster i 2 minutter efterfulgt af inkubation i 20 minutter ved RT, og læs derefter luminescens på en pladelæser. Figur lavet ved hjælp af BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Cellens levedygtighed. Cellelevedygtighedsdata for organoider i 0,1% dimethylsulfoxid (DMSO) for seks tekniske replikater af fire organoider til fire patientprøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Komponent | Kvantitet |
| Neurobasalt medium minus phenol rød | 500 ml |
| B-27 tilskud minus vitamin A (50x) | 10 ml |
| Antibiotika-antimykotisk (100x) | 5 ml |
| Natriumpyruvat (100 mM) | 5 ml |
| Glutamin i 0,85% NaCl (200 mM) | 5 ml |
| Rekombinant human FGF basis (250 μg/ml) | 20 μL |
| Rekombinant humant EFG-protein (250 μg/ml) | 20 μL |
| Phenol rød | 500 μL |
Tabel 1: Neurobasal medium komplet (NBMc) formulering
| Reagens | Tidspunkt |
| 50% ethanol | 3 minutter |
| 75% ethanol | 3 minutter |
| 95% ethanol | 3 minutter |
| 95% ethanol | 4 minutter |
| 100% ethanol | 2 minutter |
| 100% ethanol | 3 minutter |
| 100% ethanol | 4 minutter |
| Xylen erstatning | 2 minutter |
| Xylen erstatning | 3 minutter |
| Xylen erstatning | 4 minutter |
| Paraffinvoks | 15 minutter |
| Paraffinvoks | 15 minutter |
Tabel 2: Behandlingsplan for små organoider (under 3 mm i diameter)
| Reagens | Tidspunkt |
| 50% ethanol | 6 minutter |
| 75% ethanol | 6 minutter |
| 95% ethanol | 5 minutter |
| 95% ethanol | 8 minutter |
| 100% ethanol | 5 minutter |
| 100% ethanol | 5 minutter |
| 100% ethanol | 8 minutter |
| Xylen erstatning | 5 minutter |
| Xylen erstatning | 5 minutter |
| Xylen erstatning | 8 minutter |
| Paraffinvoks | 30 minutter |
| Paraffinvoks | 30 minutter |
Tabel 3: Behandlingsplan for store organoider (over 3 mm i diameter)
| Reagens | Tidspunkt |
| Hæmatoxylin | 2 minutter |
| Løbende diH2O | 2 minutter |
| Nuklear hæmatoxylin afklarende reagens | 1 minut |
| Løbende diH2O | 1 minut |
| Bluing Reagens | 1 minut |
| Løbende diH2O | 2 minutter |
| 70% ethanol | 1 minut |
| 100% ethanol | 1 minut |
| 100% ethanol | 1 minut |
| Xylen erstatning | 2 minutter |
| Xylen erstatning | 2 minutter |
Tabel 4: Hematoxylin modfarve
Discussion
GBM-organoider er en komplementær kulturmetode til traditionelle sfærer, der inkluderer større cellulær og mikromiljømæssig heterogenitet 4,22,30. Selvom det er mere tids- og ressourcekrævende, kan organoidkultur give værdifuld indsigt i intratumoral adfærd og mekanismer for lægemiddelresistens.
GBM er drevet af en population på CSC'er 5,31, og disse metoder blev udviklet for at muliggøre fortsat vækst og selvfornyelse af denne CSC-population. Epidermal vækstfaktor (EGF) og fibroblastvækstfaktor (FGF) er kendt for at forbedre stamcellevedligeholdelse og vækst og give aktiv receptortyrosinkinase (RTK) signalering. Dannelsen af heterogene cellulære populationer og forskellige tumormikromiljøer inden for GBM-tumorer er afhængig af at understøtte CSC-adfærd. Udvælgelsen af en lrECM efterligner det lamininrige hjernemiljø og understøtter cellerne i organoidkulturen til selvorganisering og migration ved invasion. Selvom nogle grupper har etableret organoidkultur uden brug af et lrECM- eller EGF / FGF-beriget medie24,28, som kan tilbyde en mere tidseffektiv måde at bruge denne dyrkningsmetode på og stærkere udvælgelse af onkogen signalering for at drive vækst, blev disse metoder valgt for at optimere pro-stamcellemiljøet for bedst at etablere organoidernes cellulære heterogenitet. Både cerebrale organoider og GBM-organoider er blevet fremstillet med lrECM i litteraturen tidligere 21,32,33. Selvom vi har etableret data vedrørende tumorpopulationer, der findes inden for organoider og den rumlige variation, er der mindre kendt om ikke-tumorpopulationer inden for organoiderne, og hvor længe de overlever fra de oprindelige patientprøver. Visse IHC-pletter (såsom CD45) kan give disse data og kunne være et interessant forskningspunkt i fremtiden med organoider.
At kende den tilsigtede anvendelse til organoid kultur er vigtig for at vælge passende metoder. Etablering af organoider fra primære prøver versus dyrkning af ensartede organoider til specifikke eksperimenter har lidt forskellige procedurer. At have en forståelse for, hvordan organoider modnes og visuelt udfylder lrECM-stilladset, er vigtigt for at kunne allokere ordentlig tid og ressourcer til organoidkultur. Sparsomme områder af celler i organoider vil langsomt udvide sig og vokse for at fylde lrECM, hvilket kan tage alt fra 2-8 uger afhængigt af prøvens adfærd. Denne vækstrate er noget iboende for hver prøve; det bevares på tværs af forskellige partier af organoider og er ret i overensstemmelse med den relative hastighed af kuglevækst. Organoider kan opretholdes i over 1 år og bevare tumordannelsesevner på xenograft i mus; Det anbefales dog at dyrke dem med et særskilt formål for ikke at spilde laboratorieressourcer (både materialer og tid)4. Organoidvækst er blevet testet i flere brøndstørrelser og formater og viser, at en 10 cm plade er den ideelle indstilling til opretholdelse af optimal cellelevedygtighed efterfulgt af en 6-brøndsplade med tre organoider pr. Brønd34. Organoider bruger flere medier sammenlignet med deres todimensionelle kulturmodstykker, og brug af et mindre brøndformat fører ikke til korrekt vedligeholdelse. For eksempel har en brønd i en plade med 96-brøndformat ikke nok plads eller medievolumen i forhold til størrelsen på en organoid til at opretholde organoidvækst.
Som organoider etablerer, er det vigtigt at være opmærksom for at øge succesen. I første omgang vil organoider forbruge medier langsomt, men efterhånden som de bliver tættere og mere modne, vil de forbruge medier hurtigere. Tilføjelse af phenolrød til medierne kan hjælpe med at tjene som indikator for medieforbrug. Når mediet er mere gult, kan det få os til at justere fodringsmønsteret, hvad enten det er at udveksle et større volumen medier, øge den samlede mediemængde i pladen, opdele organoider mellem flere cellekulturplader for at holde trit med deres vækst eller endda justere tidslinjen for eksperimenter.
På mange måder er organoider en ineffektiv måde at udføre kræftforskning på. De involverer lange tidsskalaer og er dyre og ressourcetunge sammenlignet med GBM-sfærekulturen. Sammenlignet med patientafledte xenotransplantater, en alternativ metode til genskabelse af cellulær og mikromiljømæssig mangfoldighed, er de imidlertid mere ligetil, billigere og kontrollerbare. Udvælgelse af, hvornår man bedst kan bruge organoider, er vigtigt for kræftforskere. De er ikke beregnet til at erstatte traditionel sfære eller tilhængerkultur og ikke til at erstatte xenograftmodeller. Organoider kan, når de anvendes på det rigtige videnskabelige spørgsmål, kombinere fordelene ved begge disse systemer og kan give os mulighed for at observere tumorcellebiologi, der ellers ville forblive skjult. Det videnskabelige samfund er kun begyndt at forstå, hvilke læringsmuligheder organoider tilbyder, men det er klart, at de vil være et uvurderligt værktøj i fremtiden til at forstå GBM's komplekse biologi.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Justin Lathia for hans uvurderlige råd og løbende støtte. Vi takker også Katrina Fife, Lisa Wallace og Maya Camhi for deres fremragende tekniske support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets | MP Biomedicals | 08980681 | 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets |
| 96-well PCR plates | ThermoFisher Scientific | 96-well PCR plates | |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | SCR005 | Cell detachment solution |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Antibiotic-antimycotic |
| B-27 supplement minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587001 | B-27 supplement minus vitamin A (50x) |
| GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24590 | Bluing reagent |
| Cell strainer (70 µm) | CellTreat Scientific | 229483 | Cell strainer (70 µm) |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | Luminescent cell viability assay |
| Clarifier 2 | ThermoFisher Scientific | 7301 | Nuclear hematoxylin clarifying reagent |
| Clear-Rite 3 | ThermoFisher Scientific | 6901 | xylene substitute |
| Epredia Gill 2 Hematoxylin | ThermoFisher Scientific | 72504 | Hematoxylin |
| Glutamine in 0.85% NaCl | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM) |
| Matrigel | ThermoFisher Scientific | 354234 | Laminin-enriched extracellular matrix |
| Mini PAP pen | ThermoFisher Scientific | 008877 | Hydrophobic barrier pen |
| Mounting medium | ThermoFisher Scientific | 22-050-102 | Mounting medium |
| Neurobasal media minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12349015 | Neurobasal media minus phenol red (500 mL) |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Normal donkey serum (NDS) |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | Paraformaldehyde 4% in PBS |
| Phenol red | Sigma | P0290 | Phenol red (0.5%) |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P10144 | Liquid curing mountant |
| Recombinant human EGF protein | R&D systems | 236-EG-01M | Recombinant human EGF protein (250 µg/mL) |
| Recombinant human FGF basic | R&D systems | 4144-TC-01 | Recombinant human FGF basic (250 µg/mL) |
| SignalStain Antibody Diluent | Cell Signaling | 8112 | Antibody diluent |
| SignalStain Boost IHC Detection Reagent | Cell Signaling | 8114 | Immunohistochemistry detection reagent |
| SignalStain Citrate Unmasking Solution | Cell Signaling | 14746 | Citrate unmasking solution |
| Single edge razor blade | Uline | H-595B | Single edge razor blade |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360070 | Sodium pyruvate (100 mM) |
| Tissue-Tek Cryomolds | VWR | 25608-916 | Disposable cryomolds |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Optimal cutting temperature compound |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | T10282 | Cell impermeant stain (0.4%) |
| Xylene | ThermoFisher Scientific | X3P-1GAL | Xylene |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective. Frontiers in Materials. 5, 7 (2018).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
- Hubert, C. G., et al. A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).
- Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment. Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).
- Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).
- Yu, S. C., Bian, X. W. Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Zhu, T. S., et al. Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells. Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Charles, N., et al. Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells. Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).
- Seidel, S., et al. A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha. Brain. 133, 983-995 (2010).
- Yan, K., et al. Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy. Genes & Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).
- Cheng, L., et al. Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth. Cell. 153 (1), 139-152 (2013).
- Flavahan, W. A., et al. Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake. Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).
- Hjelmeland, A. B., et al. Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Li, Z., et al. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).
- Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids. Biology Open. 10 (2), 056416 (2021).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).
- da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 23 (8), 862-868 (2018).
- Jacob, F., et al. A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Lenin, S., et al. A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322 (2021).
- Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255 (2021).
- Shakya, S., et al. Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101 (2021).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Sundar, S. J., et al. Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma. Translational Oncology. 15 (1), 101251 (2021).
