בידוד של פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לבידוד פראדיפוציטים מרקמת שומן בעוברי ברוילר. שיטה זו מאפשרת בידוד עם תפוקה גבוהה, תרבית ראשונית והתמיינות אדיפוגנית של פראדיפוציטים. צביעת O אדום שמן וכתם שומנים/דנ”א מדדו את היכולת האדיפוגנית של תאים מבודדים המושרים עם אמצעי התמיינות.
Abstract
פרדיפוציטים ראשוניים הם מערכת ניסויים רבת ערך להבנת המסלולים המולקולריים השולטים בהתמיינות אדיפוציטים ובחילוף החומרים. עוברי עוף מספקים את ההזדמנות לבודד פראדיפוציטים מהשלב המוקדם ביותר של התפתחות השומן. תא ראשוני זה יכול לשמש לזיהוי גורמים המשפיעים על התפשטות פראדיפוציטים והתמיינות אדיפוגנית, מה שהופך אותם למודל רב ערך למחקרים הקשורים להשמנת יתר בילדות ושליטה בתצהיר שומן עודף בעופות. הצמיחה המהירה של רקמת השומן לאחר הלידה מבזבזת למעשה את ההזנה על ידי הקצאתה הרחק מצמיחת השרירים בתרנגולות ברוילר. לכן, שיטות להבנת השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות רקמת השומן עשויות לספק רמזים לווסת נטייה זו ולזהות דרכים להגביל את התפשטות השומן בשלב מוקדם בחיים. המחקר הנוכחי נועד לפתח שיטה יעילה לבידוד, לתרבית ראשונית ולהבחנה אדיפוגנית של פראדיפוציטים שבודדו מרקמת שומן מתפתחת של עוברי אפרוחים מסחריים מסוג ברוילר (סוג בשר). ההליך עבר אופטימיזציה כדי להניב תאים עם כדאיות גבוהה (~ 98%) ויכולת מוגברת להתמיין לאדיפוציטים בוגרים. שיטה פשוטה זו של בידוד, תרבית והתמיינות של פראדיפוציטים עובריים תומכת בניתוחים פונקציונליים של גדילת השומן והתפתחותו בתחילת החיים.
Introduction
השמנת יתר היא איום בריאותי עולמי על מבוגרים וילדים כאחד. ילדים הסובלים מעודף משקל או מהשמנת יתר נמצאים בסיכון גבוה פי חמישה בערך להיות שמנים כמבוגרים, מה שמציב אותם בסיכון מוגבר באופן משמעותי למחלות לב וכלי דם, סוכרת ותחלואה נלווית רבים אחרים. כ -13.4% מהילדים בארה”ב בגילאי 2-5 סובלים מהשמנת יתר1, מה שממחיש כי הנטייה לצבור עודפי שומן בגוף יכולה להיות מופעלת בשלב מוקדם מאוד בחיים. מסיבות שונות מאוד, הצטברות של עודף רקמת שומן היא דאגה עבור תרנגולות broiler (סוג בשר). ברוילרים מודרניים יעילים להפליא אך עדיין צוברים יותר שומנים ממה שנחוץ מבחינה פיזיולוגית 2,3. נטייה זו מתחילה זמן קצר לאחר הבקיעה ולמעשה מבזבזת מזון, מרכיב הייצור היקר ביותר, על ידי הקצאתו הרחק מצמיחת השרירים. לכן, הן עבור ילדים והן עבור תרנגולות broiler, אם כי מסיבות שונות מאוד, יש צורך להבין גורמים המשפיעים על התפתחות רקמת השומן ולזהות דרכים להגביל את התפשטות השומן בשלב מוקדם בחיים.
אדיפוציטים נוצרים מפראדיפוציטים, תאי גזע שמקורם ברקמת השומן שעוברים התמיינות כדי לפתח תאי שומן בוגרים המאחסנים שומנים. לפיכך, פראדיפוציטים במבחנה הם מודל ניסיוני רב ערך למחקרי השמנת יתר. תאים אלה, המבודדים מחלק כלי הדם הסטרומיים של מחסני השומן, יכולים לספק הבנה בסיסית של מסלולים מולקולריים השולטים בהתמיינות האדיפוציטים ובחילוף החומרים 4,5. עוברי אפרוחים הם מודל ניסיוני נוח במחקרים התפתחותיים מכיוון שצבירת ביציות בלוח הזמנים הרצוי מקלה על מניפולציה ניסיונית, שכן היא מאפשרת להשיג עוברים ללא הקרבה של האם כדי לצפות בסדרה של שלבים התפתחותיים של עוברים. יתר על כן, הליכים כירורגיים מסובכים ותקופות זמן ממושכות אינם נדרשים כדי להשיג עוברים ביחס למודלים גדולים יותר של בעלי חיים. לכן, עובר האפרוח מציג הזדמנות להשיג פרדיפוציטים מהשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות רקמת השומן. רקמת שומן תת עורית נראית באפרוח סביב היום העוברי 12 (E12) כמחסן מוגדר בבירור הממוקם סביב הירך. מחסן זה מועשר בפראדיפוציטים מתרבים מאוד שעוברים באופן פעיל התמיינות תחת רמזים התפתחותיים ליצירת אדיפוציטים בוגרים 6,7. תהליך ההבחנה האדיפוגנית דומה בין תרנגולות לבני אדם. לכן, פראדיפוציטים המבודדים מעוברי אפרוחים יכולים לשמש כמודל דו-תכליתי למחקרים הרלוונטיים לבני אדם ועופות. עם זאת, התשואה של preadipocytes יורד עם ההזדקנות ככל שהתאים גדלים לתוך אדיפוציטים בוגרים5.
הפרוטוקול הנוכחי מייעל את הבידוד של פראדיפוציטים מרקמת השומן במהלך השלב (E16-E18) שבו התמיינות אדיפוגנית והיפרטרופיה של אדיפוציטים נמצאים בשיאם בעוברי אפרוחי ברוילר8. הליך זה יכול להעריך את ההשפעות של גורמים שאליהם העובר המתפתח נחשף באובו, כגון תזונת התרנגולת, על התפתחות אדיפוציטים ופוטנציאל אדיפוגני ex vivo. הוא יכול גם לבחון את ההשפעה של מניפולציות שונות (למשל, היפוקסיה, תוספות מזינות, אגוניסטים פרמקולוגיים ואנטגוניסטים) על אדיפוגנזה או על ה’אומות’ השונות (למשל, תעתיק, מטבוליום, מתילום) של אבות אדיפוציטים. כייצוג של השלב המוקדם ביותר של היווצרות השומן, תאים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה הם מודלים חשובים למחקרים הרלוונטיים לעופות ולבני אדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
אף על פי שכמה פרוטוקולים שתוארו היטב דיווחו על בידוד של פרדיפוציטים 14,15,16,17, בידוד עבור פראדיפוציטים עובריים עבר אופטימיזציה, אשר יכול לשמש לניתוחים פונקציונליים של צמיחת שומן מוקדם בחיים והתפתחות אצל אפרוחי ברוילר. פר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ל- UT AgResearch ולמחלקה למדעי בעלי החיים על התמיכה והאופטימיזציה של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק USDA.
Materials
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | Evos | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. . Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- . Corning Cell Counter Demo Video Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022)
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. . Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).
