Summary

בידוד של פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר

Published: August 04, 2022
doi:

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לבידוד פראדיפוציטים מרקמת שומן בעוברי ברוילר. שיטה זו מאפשרת בידוד עם תפוקה גבוהה, תרבית ראשונית והתמיינות אדיפוגנית של פראדיפוציטים. צביעת O אדום שמן וכתם שומנים/דנ”א מדדו את היכולת האדיפוגנית של תאים מבודדים המושרים עם אמצעי התמיינות.

Abstract

פרדיפוציטים ראשוניים הם מערכת ניסויים רבת ערך להבנת המסלולים המולקולריים השולטים בהתמיינות אדיפוציטים ובחילוף החומרים. עוברי עוף מספקים את ההזדמנות לבודד פראדיפוציטים מהשלב המוקדם ביותר של התפתחות השומן. תא ראשוני זה יכול לשמש לזיהוי גורמים המשפיעים על התפשטות פראדיפוציטים והתמיינות אדיפוגנית, מה שהופך אותם למודל רב ערך למחקרים הקשורים להשמנת יתר בילדות ושליטה בתצהיר שומן עודף בעופות. הצמיחה המהירה של רקמת השומן לאחר הלידה מבזבזת למעשה את ההזנה על ידי הקצאתה הרחק מצמיחת השרירים בתרנגולות ברוילר. לכן, שיטות להבנת השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות רקמת השומן עשויות לספק רמזים לווסת נטייה זו ולזהות דרכים להגביל את התפשטות השומן בשלב מוקדם בחיים. המחקר הנוכחי נועד לפתח שיטה יעילה לבידוד, לתרבית ראשונית ולהבחנה אדיפוגנית של פראדיפוציטים שבודדו מרקמת שומן מתפתחת של עוברי אפרוחים מסחריים מסוג ברוילר (סוג בשר). ההליך עבר אופטימיזציה כדי להניב תאים עם כדאיות גבוהה (~ 98%) ויכולת מוגברת להתמיין לאדיפוציטים בוגרים. שיטה פשוטה זו של בידוד, תרבית והתמיינות של פראדיפוציטים עובריים תומכת בניתוחים פונקציונליים של גדילת השומן והתפתחותו בתחילת החיים.

Introduction

השמנת יתר היא איום בריאותי עולמי על מבוגרים וילדים כאחד. ילדים הסובלים מעודף משקל או מהשמנת יתר נמצאים בסיכון גבוה פי חמישה בערך להיות שמנים כמבוגרים, מה שמציב אותם בסיכון מוגבר באופן משמעותי למחלות לב וכלי דם, סוכרת ותחלואה נלווית רבים אחרים. כ -13.4% מהילדים בארה”ב בגילאי 2-5 סובלים מהשמנת יתר1, מה שממחיש כי הנטייה לצבור עודפי שומן בגוף יכולה להיות מופעלת בשלב מוקדם מאוד בחיים. מסיבות שונות מאוד, הצטברות של עודף רקמת שומן היא דאגה עבור תרנגולות broiler (סוג בשר). ברוילרים מודרניים יעילים להפליא אך עדיין צוברים יותר שומנים ממה שנחוץ מבחינה פיזיולוגית 2,3. נטייה זו מתחילה זמן קצר לאחר הבקיעה ולמעשה מבזבזת מזון, מרכיב הייצור היקר ביותר, על ידי הקצאתו הרחק מצמיחת השרירים. לכן, הן עבור ילדים והן עבור תרנגולות broiler, אם כי מסיבות שונות מאוד, יש צורך להבין גורמים המשפיעים על התפתחות רקמת השומן ולזהות דרכים להגביל את התפשטות השומן בשלב מוקדם בחיים.

אדיפוציטים נוצרים מפראדיפוציטים, תאי גזע שמקורם ברקמת השומן שעוברים התמיינות כדי לפתח תאי שומן בוגרים המאחסנים שומנים. לפיכך, פראדיפוציטים במבחנה הם מודל ניסיוני רב ערך למחקרי השמנת יתר. תאים אלה, המבודדים מחלק כלי הדם הסטרומיים של מחסני השומן, יכולים לספק הבנה בסיסית של מסלולים מולקולריים השולטים בהתמיינות האדיפוציטים ובחילוף החומרים 4,5. עוברי אפרוחים הם מודל ניסיוני נוח במחקרים התפתחותיים מכיוון שצבירת ביציות בלוח הזמנים הרצוי מקלה על מניפולציה ניסיונית, שכן היא מאפשרת להשיג עוברים ללא הקרבה של האם כדי לצפות בסדרה של שלבים התפתחותיים של עוברים. יתר על כן, הליכים כירורגיים מסובכים ותקופות זמן ממושכות אינם נדרשים כדי להשיג עוברים ביחס למודלים גדולים יותר של בעלי חיים. לכן, עובר האפרוח מציג הזדמנות להשיג פרדיפוציטים מהשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות רקמת השומן. רקמת שומן תת עורית נראית באפרוח סביב היום העוברי 12 (E12) כמחסן מוגדר בבירור הממוקם סביב הירך. מחסן זה מועשר בפראדיפוציטים מתרבים מאוד שעוברים באופן פעיל התמיינות תחת רמזים התפתחותיים ליצירת אדיפוציטים בוגרים 6,7. תהליך ההבחנה האדיפוגנית דומה בין תרנגולות לבני אדם. לכן, פראדיפוציטים המבודדים מעוברי אפרוחים יכולים לשמש כמודל דו-תכליתי למחקרים הרלוונטיים לבני אדם ועופות. עם זאת, התשואה של preadipocytes יורד עם ההזדקנות ככל שהתאים גדלים לתוך אדיפוציטים בוגרים5.

הפרוטוקול הנוכחי מייעל את הבידוד של פראדיפוציטים מרקמת השומן במהלך השלב (E16-E18) שבו התמיינות אדיפוגנית והיפרטרופיה של אדיפוציטים נמצאים בשיאם בעוברי אפרוחי ברוילר8. הליך זה יכול להעריך את ההשפעות של גורמים שאליהם העובר המתפתח נחשף באובו, כגון תזונת התרנגולת, על התפתחות אדיפוציטים ופוטנציאל אדיפוגני ex vivo. הוא יכול גם לבחון את ההשפעה של מניפולציות שונות (למשל, היפוקסיה, תוספות מזינות, אגוניסטים פרמקולוגיים ואנטגוניסטים) על אדיפוגנזה או על ה’אומות’ השונות (למשל, תעתיק, מטבוליום, מתילום) של אבות אדיפוציטים. כייצוג של השלב המוקדם ביותר של היווצרות השומן, תאים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה הם מודלים חשובים למחקרים הרלוונטיים לעופות ולבני אדם.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טנסי. ביצי ברוילר מסחריות מופרות טריות (קוב 500) התקבלו ממדגרה מקומית. ביצים דוגרו בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס עם 60% לחות יחסית עד לניתוחים בימים העובריים 16-18 (E16-E18). רקמת השומן נאספה מהמחסן התת עורי (עצם הי?…

Representative Results

פראדיפוציטים ראשוניים דומים מבחינה מורפולוגית לפיברובלסטים, עם צורות לא סדירות דמויות כוכבים וגרעין מרכזי (איור 2A-C). התאים נצמדים בקלות לפלסטיק תרבית רקמה ומתחילים להתרבות זמן קצר לאחר ההתקשרות. הם מתמיינים במהירות וצוברים טיפות שומנים (איו?…

Discussion

אף על פי שכמה פרוטוקולים שתוארו היטב דיווחו על בידוד של פרדיפוציטים 14,15,16,17, בידוד עבור פראדיפוציטים עובריים עבר אופטימיזציה, אשר יכול לשמש לניתוחים פונקציונליים של צמיחת שומן מוקדם בחיים והתפתחות אצל אפרוחי ברוילר. פר…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים ל- UT AgResearch ולמחלקה למדעי בעלי החיים על התמיכה והאופטימיזציה של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק USDA.

Materials

1 mL Pipette Eppendorf Z683825 Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL
1 mL Pipette Tip Fisher Scientific 02-707-402
100% Isopropanol Fisher Scientific A426P4
1x PBS Gibco 10010023
25 mL Flask Pyrex 4980-25
37% Formaldehyde Fisher Scientific F75P-1GAL
6-Well Plate Falcon 353046 Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate Costar 3632
96-Well Plate, Black Bottom Costar 3603 Tissue Culture-treated
AdipoRed Lonza PT-7009
Amphotericin B Gibco 15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper) Kimberly-Clark 34155
Betadine Up & Up NDC 1167300334 20% Working Solution
Cell Counter Corning 6749
Cell Strainer, 40 µm SPL 93040
Centrifugaton Eppendorf 5702
Chicken Serum Gibco 16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL VWR 10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL Falcon 352098
Cryovial Nunc 343958
Curved Forceps, 100 mm Roboz Surgical RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm Roboz Surgical RS-6839
Distilled Water Millipore SYNSV0000 Despensed as needed
DMEM/F12 HyClone SH30023.01
DMSO Sigma D2650
Ethanol Decon Labs 2701 70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10437028
Fluorescent Microscope Evos M7000
Fluorescent Plate Reader Biotek Synergy H1
Foil Reynolds Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container Thermo Scientific 5100-0001
Gelatin Millipore 4055 2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber) Corning 480200 0.1 mm deep
Incubator Fisher Scientific 6845
Instrument Sterilizer VWR B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin Sigma L9655 1x Working Solution
Microscope Evos AMEX1000
Multi-Channel Pipette Thermo Scientific 4661070 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL
Na2HPO4 Sigma S-7907
NaH2PO4 Sigma S-3139
NucBlue Invitrogen R37605
Oil Red O Sigma O-0625
Orbital Shaker IKA KS130BS1
Paper Towel Tork RK8002
Parafilm Parafilm M PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S) Gibco 15140122 1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm Falcon 351029
Petri dishes, 60 mm Falcon 351007
Plate Shaker VWR 200
RBC Lysis Buffer Roche 11814389001
Reagent Reservior VWR 89094-680
Small Beaker, 100 mL Pyrex 1000-100
Spectrophotometer Plate Reader Biotek Synergy H1
Sterile Gauze McKesson 762703
Straight Forceps, 120 mm Roboz Surgical RS-4960
Straight Scissors, 140 mm Roboz Surgical RS-6762
T-25 Flask Corning 430639 Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator Thermo Scientific 50144906
Tissue Strainer, 250 µm Pierce 87791
Trypan Blue Stain Gibco 15250061
Trypsin Gibco 15400054 0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm Roboz Surgical RS-5035
Type 1 Collagenase Gibco 17100017
Water Bath Fisher Scientific 15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper Whatman 1001-110

References

  1. Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. . Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
  2. Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
  3. Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
  4. Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
  5. Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
  6. Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
  7. Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
  8. Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
  9. Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
  10. . Corning Cell Counter Demo Video Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022)
  11. Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
  12. Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
  13. Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
  14. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. . Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).
  15. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
  16. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  17. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
  18. Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
  19. Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
  20. Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
  21. Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).

Play Video

Cite This Article
Kim, M., Jung, U., Shepherd, E., Mihelic, R., Voy, B. H. Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos. J. Vis. Exp. (186), e63861, doi:10.3791/63861 (2022).

View Video