توصيف الخواص الميكانيكية للجدار الخلوي الأولي في أعضاء النبات الحي باستخدام مجهر القوة الذرية
Summary
تعد دراسات الميكانيكا الحيوية لجدار الخلية ضرورية لفهم نمو النبات والتشكل. يقترح البروتوكول التالي لدراسة جدران الخلايا الأولية الرقيقة في الأنسجة الداخلية لأعضاء النبات الفتية باستخدام مجهر القوة الذرية.
Abstract
تحدد الخواص الميكانيكية للجدران الخلوية الأولية اتجاه نمو الخلايا النباتية ومعدله، ومن ثم تحديد حجم النبات وشكله في المستقبل. تم تطوير العديد من التقنيات المتطورة لقياس هذه الخصائص. ومع ذلك ، يظل الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) هو الأكثر ملاءمة لدراسة مرونة جدار الخلية على المستوى الخلوي. كان أحد أهم قيود هذه التقنية هو أنه يمكن دراسة الخلايا الحية السطحية أو المعزولة فقط. هنا ، يتم تقديم استخدام مجهر القوة الذرية للتحقيق في الخواص الميكانيكية لجدران الخلايا الأولية التي تنتمي إلى الأنسجة الداخلية لجسم النبات. يصف هذا البروتوكول قياسات معامل يونغ الظاهر لجدران الخلايا في الجذور ، ولكن يمكن أيضا تطبيق الطريقة على أعضاء النبات الأخرى. يتم إجراء القياسات على أقسام مشتقة من الاهتزاز من المواد النباتية في خلية سائلة ، مما يسمح (i) بتجنب استخدام محاليل البلازما أو تشريب العينة بالشمع أو الراتنج ، (ii) جعل التجارب سريعة ، و (iii) منع جفاف العينة. يمكن دراسة كل من جدران الخلايا المضادة للانحناء و periclinal ، اعتمادا على كيفية تقسيم العينة. يمكن التحقيق في الاختلافات في الخواص الميكانيكية للأنسجة المختلفة في قسم واحد. يصف البروتوكول مبادئ تخطيط الدراسة ، والقضايا المتعلقة بإعداد العينات والقياسات ، وكذلك طريقة اختيار منحنيات تشوه القوة لتجنب تأثير التضاريس على القيم التي تم الحصول عليها من معامل المرونة. لا تقتصر الطريقة على حجم العينة ولكنها حساسة لحجم الخلية (أي يصعب فحص الخلايا ذات التجويف الكبير).
Introduction
تحدد الخواص الميكانيكية لجدار الخلية النباتية شكل الخلية وقدرتها على النمو. على سبيل المثال ، يكون الطرف المتنامي لأنبوب حبوب اللقاح أكثر ليونة من الأجزاء غير النامية من نفس الأنبوب1. يسبق تكوين البدائية على مرستيم أرابيدوبسيس انخفاض موضعي في صلابة جدار الخلية في موقع البدائيةالمستقبلية 2,3. جدران الخلايا في Arabidopsis hypocotyl ، الموازية لمحور النمو الرئيسي وتنمو بشكل أسرع ، أكثر ليونة من تلك المتعامدة مع هذا المحور وتنمو بشكل أبطأ 4,5. في جذر الذرة ، كان انتقال الخلايا من الانقسام إلى الاستطالة مصحوبا بانخفاض في الوحدات المرنة في جميع أنسجة الجذر. ظلت الوحدات منخفضة في منطقة الاستطالة وزادت في منطقة الاستطالةالمتأخرة 6.
على الرغم من توفر طرق مختلفة ، نادرا ما تتم مقارنة المصفوفات الكبيرة من المعلومات الكيميائية الحيوية والوراثية حول بيولوجيا جدار الخلية التي يتم الحصول عليها سنويا مع الخواص الميكانيكية لجدران الخلايا. على سبيل المثال ، غالبا ما تكون الطفرات الموجودة على الجينات المرتبطة بجدار الخلية قد غيرت النمو والتطور4،7،8 ، ولكن نادرا ما يتم وصفها من حيث الميكانيكا الحيوية. أحد أسباب ذلك هو صعوبة إجراء القياسات على المستويين الخلوي ودون الخلوي. يعد مجهر القوة الذرية (AFM) حاليا النهج الأساسي لمثل هذه التحليلات9.
في السنوات الأخيرة ، تم إجراء العديد من الدراسات القائمة على AFM حول الميكانيكا الحيوية لجدار الخلية النباتية. تم فحص الخواص الميكانيكية لجدران الخلايا للأنسجة الخارجية ل Arabidopsis2،3،4،5،10،11 والبصل 12 ، وكذلك الخلايا المستزرعة13،14،15. ومع ذلك ، قد تحتوي الخلايا السطحية للنبات على جدران خلوية تختلف خواصها الميكانيكية عن تلك الموجودة في الأنسجة الداخلية6. بالإضافة إلى ذلك ، يتم ضغط الخلايا النباتية بواسطة التورم مما يجعلها أكثر صلابة. للتخلص من تأثير ضغط التورم ، يتعين على الباحثين استخدام محاليل البلازما2،3،4،5،10،11 أو تحلل القيم التي تم الحصول عليها في مساهمات التورم وجدار الخلية 12. يؤدي النهج الأول إلى تجفيف العينة ويغير سمك وخصائص جدار الخلية16 ، بينما يتطلب النهج الثاني قياسات إضافية ورياضيات معقدة ، وينطبق فقط على الخلايا ذات الشكل البسيط نسبيا12. يمكن تقييم خصائص جدار الخلية للأنسجة الداخلية على عمليات التجميد17 أو أقسام من المواد النباتية المشربة بالراتنج8. ومع ذلك ، فإن كلتا الطريقتين تنطوي على الجفاف و / أو التشريب للعينات ، مما يؤدي حتما إلى تغييرات في الخصائص. من الصعب ربط خصائص الخلايا المعزولة أو المستزرعة بفسيولوجيا النبات بأكمله. يمكن أن تؤثر كل من زراعة الخلايا النباتية وعزلها على الخواص الميكانيكية لجدرانها الخلوية.
الطريقة المعروضة هنا تكمل النهج المذكورة أعلاه. باستخدامه ، يمكن فحص جدران الخلايا الأولية لأي نسيج وفي أي مرحلة من مراحل تطور النبات. تم إجراء ملاحظات التقسيم و AFM في السائل الذي يتجنب جفاف العينة. تم حل مشكلة التورم حيث يتم قطع الخلايا. يصف البروتوكول العمل مع جذور الذرة والجاودار ، ولكن يمكن فحص أي عينة أخرى إذا كانت مناسبة لتقسيم الاهتزاز.
تم إجراء دراسات AFM الموصوفة هنا باستخدام تقنية حجم القوة. تستخدم الأدوات المختلفة أسماء مختلفة لهذه الطريقة. ومع ذلك ، فإن المبدأ الأساسي هو نفسه. يتم الحصول على خريطة حجم القوة للعينة عن طريق حركة جيبية أو مثلثة للناتئ (أو العينة) لتحقيق قوة تحميل معينة في كل نقطة تم تحليلها ، أثناء تسجيل انحراف الكابولي18. تجمع النتيجة بين صورة طبوغرافية للسطح ومجموعة منحنيات مسافة القوة. يستخدم كل منحنى لحساب التشوه والصلابة ومعامل يونغ والالتصاق وتبديد الطاقة عند نقطة محددة. يمكن الحصول على بيانات مماثلة عن طريق التحليل الطيفي للقوة نقطة بنقطة بعد المسح في وضع الاتصال19 ، على الرغم من أنه يستغرق وقتا أطول.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحدد الخواص الميكانيكية للجدران الخلوية الأولية اتجاه نمو الخلايا النباتية ومعدله، ومن ثم حجم النبات وشكله في المستقبل. الطريقة القائمة على AFM المقدمة هنا تكمل التقنيات الحالية التي تستخدم لدراسة خصائص جدران الخلايا النباتية. يسمح بفحص مرونة جدران الخلايا ، التي تنتمي إلى الأنسجة الداخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعرب عن تقديرنا للدكتور ديمتري سوسلوف (جامعة سانت بطرسبرغ الحكومية ، سانت بطرسبرغ ، روسيا) والبروفيسور ميرا بونوماريفا (معهد التتار للبحوث العلمية للزراعة ، FRC KazSC RAS ، قازان ، روسيا) لتوفير بذور الذرة والجاودار ، على التوالي. تم تطوير الطريقة المقدمة في إطار مشروع مؤسسة العلوم الروسية رقم 18-14-00168 الممنوح لشركة LK. تم تنفيذ جزء العمل (الحصول على النتائج المقدمة) من قبل AP بدعم مالي من التكليف الحكومي لمركز FRC Kazan العلمي التابع ل RAS.
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. 발생학. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
