Karakterisera mekaniska egenskaper hos primär cellvägg i levande växtorgan med hjälp av atomkraftsmikroskopi
Summary
Studier av cellväggsbiomekanik är viktiga för att förstå växttillväxt och morfogenes. Följande protokoll föreslås för att undersöka tunna primära cellväggar i de inre vävnaderna hos unga växtorgan med hjälp av atomkraftmikroskopi.
Abstract
De mekaniska egenskaperna hos de primära cellväggarna bestämmer riktningen och hastigheten för växtcelltillväxt och därmed växtens framtida storlek och form. Många sofistikerade tekniker har utvecklats för att mäta dessa egenskaper; atomkraftmikroskopi (AFM) är dock fortfarande den mest praktiska för att studera cellväggselasticitet på cellulär nivå. En av de viktigaste begränsningarna med denna teknik har varit att endast ytliga eller isolerade levande celler kan studeras. Här presenteras användningen av atomkraftmikroskopi för att undersöka de mekaniska egenskaperna hos primära cellväggar som tillhör de inre vävnaderna i en växtkropp. Detta protokoll beskriver mätningar av den uppenbara Youngs modul av cellväggar i rötter, men metoden kan också tillämpas på andra växtorgan. Mätningarna utförs på vibratom-härledda delar av växtmaterial i en flytande cell, vilket gör det möjligt att (i) undvika användning av plasmolyserande lösningar eller provimpregnering med vax eller harts, (ii) göra experimenten snabba och (iii) förhindra uttorkning av provet. Både antikliniska och perikliniska cellväggar kan studeras, beroende på hur provet sektionerades. Skillnader i de mekaniska egenskaperna hos olika vävnader kan undersökas i en enda sektion. Protokollet beskriver principerna för studieplanering, problem med provberedning och mätningar, samt metoden för att välja kraftdeformationskurvor för att undvika påverkan av topografi på de erhållna värdena för elastisk modul. Metoden är inte begränsad av provstorlek utan är känslig för cellstorlek (dvs celler med stor lumen är svåra att undersöka).
Introduction
De mekaniska egenskaperna hos växtcellväggen bestämmer cellens form och dess förmåga att växa. Till exempel är pollenrörets växande spets mjukare än de icke-växande delarna av samma rör1. Primordiabildningen på Arabidopsis meristem föregås av en lokal minskning av cellväggsstyvheten på platsen för det framtida primordium 2,3. Cellväggarna i Arabidopsis hypocotyl, som är parallella med huvudtillväxtaxeln och växer snabbare, är mjukare än de som är vinkelräta mot denna axel och växer långsammare 4,5. I majsroten åtföljdes övergången av celler från delning till förlängning av en minskning av elastisk moduli i alla vävnader i roten. Moduli förblev låg i förlängningszonen och ökade i den sena förlängningszonen6.
Trots tillgången på olika metoder jämförs sällan de stora uppsättningarna av biokemisk och genetisk information om cellväggsbiologi som erhålls årligen med cellväggarnas mekaniska egenskaper. Till exempel har mutanter på cellväggsrelaterade gener ofta förändrad tillväxt och utveckling 4,7,8, men beskrivs sällan i termer av biomekanik. En av anledningarna till detta är svårigheten att genomföra mätningar på cellulär och subcellulär nivå. Atomkraftsmikroskopi (AFM) är för närvarande den primära metoden för sådana analyser9.
Under de senaste åren har många AFM-baserade studier på växtcellväggsbiomekanik genomförts. De mekaniska egenskaperna hos cellväggarna i de yttre vävnaderna i Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 och lök 12, liksom hos odlade celler13,14,15, har undersökts. De ytliga cellerna i en växt kan emellertid ha cellväggar vars mekaniska egenskaper skiljer sig från de inre vävnaderna6. Dessutom trycksätts växtceller av turgor vilket gör dem styvare. För att bli av med påverkan av turgortrycket måste forskare använda plasmolyserande lösningar 2,3,4,5,10,11 eller sönderdela de erhållna värdena i turgor- och cellväggsbidrag 12. Det första tillvägagångssättet leder till provuttorkning och ändrar cellväggens tjocklek och egenskaper16, medan det andra tillvägagångssättet kräver ytterligare mätningar och komplicerad matematik och endast gäller celler med relativt enkel form12. Cellväggsegenskaperna hos inre vävnader kan utvärderas på kryosektioner17 eller delar av växtmaterial impregnerat med harts8. Båda metoderna innebär dock uttorkning och/eller impregnering av prover, vilket oundvikligen leder till förändringar i egenskaper. Egenskaperna hos isolerade eller odlade celler är svåra att relatera till hela växtens fysiologi. Både odling och isolering av växtceller kan påverka de mekaniska egenskaperna hos deras cellväggar.
Metoden som presenteras här kompletterar de ovan nämnda tillvägagångssätten. Med hjälp av det kan de primära cellväggarna i vilken vävnad som helst och vid varje stadium av växtutveckling undersökas. Sektionering och AFM-observationer utfördes i vätska som undviker uttorkning av provet. Problemet med turgor löstes när cellerna skärs. Protokollet beskriver arbete med majs- och rågrötter, men alla andra prover kan undersökas om det är lämpligt för vibratomsektionering.
AFM-studierna som beskrivs här utfördes med hjälp av kraftvolymtekniken. Olika instrument använder olika namn för denna metod. Grundprincipen är dock densamma; En kraftvolymkarta över provet erhålls genom en sinusformad eller triangulär rörelse av utskjutaren (eller provet) för att uppnå en viss belastningskraft vid varje analyserad punkt, samtidigt som den utskjutande böjningen18 registreras. Resultatet kombinerar en topografisk bild av ytan och uppsättningen kraftavståndskurvor. Varje kurva används för att beräkna deformation, styvhet, Youngs modul, vidhäftning och energiavledning vid en specifik punkt. Liknande data kan erhållas genom punkt-för-punkt-kraftspektroskopi efter skanning i kontaktläge19, även om det är mer tidskrävande.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mekaniska egenskaperna hos de primära cellväggarna bestämmer riktningen och hastigheten för växtcelltillväxt, och därmed växtens framtida storlek och form. Den AFM-baserade metoden som presenteras här kompletterar befintliga tekniker som används för att studera egenskaperna hos växtcellväggar. Det gör det möjligt att undersöka elasticiteten hos cellväggar, som tillhör växtens inre vävnader. Med hjälp av den presenterade metoden kartlades de mekaniska egenskaperna hos cellväggar i olika vävnader …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill ge ett erkännande till Dr. Dmitry Suslov (Sankt Petersburg State University, Sankt Petersburg, Ryssland) och Prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Ryssland) för att tillhandahålla majs respektive rågfrön. Den presenterade metoden utvecklades inom ramen för den ryska vetenskapsstiftelsens projekt nr 18-14-00168 som tilldelades LK. Den del av arbetet (erhållande av de presenterade resultaten) utfördes av AP med ekonomiskt stöd från regeringsuppdraget för FRC Kazan Scientific Center of RAS.
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. 발생학. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
