Summary
Die Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur ist eine praktikable Methode, um die Genexpression zu modulieren, ohne die Muskelkontraktilität bei Mäusen zu beeinträchtigen.
Abstract
Die transiente Genexpressionsmodulation in der murinen Skelettmuskulatur durch Plasmidelektroporation ist ein nützliches Werkzeug zur Beurteilung der normalen und pathologischen Physiologie. Die Überexpression oder der Knockdown von Zielgenen ermöglicht es den Forschern, einzelne molekulare Ereignisse zu manipulieren und so die Mechanismen, die sich auf die Muskelmasse, den Muskelstoffwechsel und die Kontraktilität auswirken, besser zu verstehen. Darüber hinaus ermöglicht die Elektroporation von DNA-Plasmiden, die für fluoreszierende Tags kodieren, den Forschern, Veränderungen in der subzellulären Lokalisation von Proteinen in der Skelettmuskulatur in vivo zu messen. Eine wichtige funktionelle Beurteilung der Skelettmuskulatur umfasst die Messung der Muskelkontraktilität. In diesem Protokoll zeigen wir, dass nach Plasmid-DNA-Injektion, Elektroporation und Genexpressionsmodulation noch Studien zur Kontraktilität des gesamten Muskels möglich sind. Das Ziel dieses Lehrverfahrens ist es, die Schritt-für-Schritt-Methode der DNA-Plasmid-Elektroporation in die Skelettmuskulatur der Maus zu demonstrieren, um die Aufnahme und Expression in den Myofasern der Musculus tibialis anterior und extensor digitorum longus zu erleichtern und zu zeigen, dass die Kontraktilität der Skelettmuskulatur nicht durch Injektion und Elektroporation beeinträchtigt wird.
Introduction
Die Plasmid-DNA-Elektroporation in die Skelettmuskulatur in vivo ist ein wichtiges Instrument zur Beurteilung von Veränderungen in der Skelettmuskelphysiologie und molekularen Signalgebung durch Modulation der Genexpression unter einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Der experimentelle Gentransfer in die Skelettmuskulatur wurde bereits 1990 von Wolff et al. demonstriert, wobei sowohl RNA als auch DNA erfolgreich ohne Elektroporation übertragen wurden und die Luciferase-Expression für mindestens 2 Monateaufrechterhalten wurde 10. Die relativ geringe Transfektionseffizienz nur bei Injektion ist problematisch, und Aihara und Miyazaki zeigten1998 einen erhöhten Gentransfer mit Elektroporation, indem sie ein pCAGGS-IL-5-Konstrukt in den Tabialis anterior (TA) -Muskel elektropolierten und die IL-5-Expression 11 des Serums maßen. Seitdem haben viele Studien die Wirksamkeit verschiedener DNA-Konzentrationen, -Volumina und -Elektroporationsparameter untersucht, um eine maximale Gentransfereffizienz zu gewährleisten. Mir et al. testeten verschiedene Elektroporationsparameter, einschließlich Spannung, Pulszahl, Pulsdauer und -frequenz sowie DNA-Konzentration, und stellten fest, dass eine höhere Spannung, Pulszahl und DNA-Konzentration zu einer erhöhten Elektroporationseffizienz beitrugen12. Ein Hauptvorbehalt gegen eine hohe Elektroporationsspannung besteht darin, dass sie zwar eine erhöhte DNA-Aufnahme in Myofasern erleichtert, aber auch Muskelschäden verursacht, die die Ergebnisse beeinträchtigen können. Schertzer et al. zeigten, dass die Elektroporation bei 200 V in etwa 50% der Myofasern 3 Tage nach der Elektroporation Schäden verursachte, während nur 10% der Myofasern bei 50 V13 beschädigt wurden. Wir haben die Variablen berücksichtigt, die den effizienten DNA-Transfer im Vergleich zu Muskelschäden beeinflussen, und festgestellt, dass eine Spannung von 125 V pro Zentimeter Bremssattelbreite ausreicht, um einen effektiven Gentransfer zu erreichen.
Die Analyse der Muskelfaserquerschnittsfläche und der gesamten Muskelkontraktilität nach der Elektroporation sind wichtige Aspekte der Methode zur Messung von Veränderungen der Muskelgröße und -funktion aufgrund der Genmodulation. Wir und andere haben bereits gezeigt, dass die Elektroporation von Kontrollvektoren allein keine Abnahme der Myofaserfläche verursacht. Das Konstrukt des grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) war in diesen Studien ein nützlicher fluoreszierender Indikator für die DNA-Transfektion13,14. Eine Reihe von Studien haben die In-situ-Kontraktilität der TA nach der Elektroporation untersucht und unterschiedliche Ergebnisse gefunden. Eine Studie zeigte, dass die 75 V / cm-Elektroporation 3 Tage nach der Elektroporation eine Verringerung der Tetankraft um etwa 30% verursachte, und 7 Tage nach der Elektroporation war die tetanische Kraft wieder auf dem Kontrollniveau, während die 50 V / cm-Elektroporation die Kraft13,15 nicht beeinträchtigte. Eine andere Studie zeigte, dass es einen 30% igen Verlust der Tetankraft 3 h nach 180 V / cm Elektroporation gab, die sich nach 7 Tagen16 auf die Scheinkraftniveaus erholte.
Im folgenden detaillierten Verfahren demonstrieren wir die Injektion und Elektroporation eines pcDNA3-EGFP-Plasmids in den TA- und Extensor digitorum longus (EDL) Muskeln von Mäusen. Wir zeigen auch, dass diese Methode die EDL-Kontraktilität des gesamten Muskels nicht beeinflusst. Ziel ist es, eine effiziente Plasmidaufnahme in Myofasern zu demonstrieren, ohne einen Funktionsverlust zu verursachen.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden am Penn State College of Medicine durchgeführt, vom Institutional Animal Care and Use Committee der Penn State University genehmigt und in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen festgelegt wurden. Für dieses Verfahren wurden 12 Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse verwendet. Alle chirurgischen Werkzeuge wurden vor dem Experimentieren auf Sterilität autoklaviert.
1. TA- und EDL-Injektions-/Elektroporationsvorbereitung
HINWEIS: Diese Schritte sind für die TA- und EDL-Injektions- / Elektroporationsvorbereitung identisch.
- Reinigen Sie Expressionsplasmidkonstrukte auf eine Konzentration von 1 μg / μL, die vor dem Experiment in sterilem PBS verdünnt werden. Für dieses Verfahren wurde ein handelsübliches endotoxinfreies Reinigungskit verwendet, um den leeren Vektor von pcDNA3-EGFP (GFP) oder pcDNA3 (Kontrolle) zu reinigen.
- Berechnen Sie die Plasmidkonzentration, um ein ausreichendes Injektionsvolumen (TA 50 μg DNA in 50 μL sterilem PBS; EDL 10 μg DNA in 10 μL sterilen PBS) und aliquot Proben.
- Programmieren Sie die Elektroporatoreinstellungen, indem Sie das Auswahlrad verwenden und das Rad drücken, um die Parameter wie folgt auszuwählen: Modus - LV, Spannung - 12,5 V/mm (zum Zeitpunkt der Einspritzung einzustellen), Pulslänge - 20 ms, Anzahl der Impulse - 5, Intervall - 200 ms, Polarität - unipolar.
- Anästhesieren Sie die Mäuse mit Isoflurangas. Legen Sie die Mäuse in eine Induktionsbox mit 5% Isofluran. Bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie durch das Fehlen des Zehenquetschreflexes mit einer Pinzette und reduzieren Sie Isofluran auf 2% Erhaltungsdosis. Bringen Sie die Mäuse für den Rest des Verfahrens zu einem geeigneten Nasenkonus, der auf einer zirkulierenden Wasserplatte bei 37 ° C ruht.
- Entfernen Sie Haare von beiden Hinterbeinen mit kleinen Haarschneidemaschinen. Schrubben Sie die unteren Gliedmaßen mit abwechselnd 70% Ethanol / Betadin, um den Injektionsbereich zu desinfizieren.
2. TA-Injektion/Elektroporation
- Wenn sich die Maus in Rückenlage befindet, lokalisieren Sie die TA-Sehne, die durch die Haut auf der seitlichen Seite des Unterschenkels sichtbar ist. Mit einer 50 μL Mikrospritze mit einer abnehmbaren 30 G Nadel führen Sie die Nadel 1-2 mm höher als die myotendinöse Verbindung in einem flachen 5°-Winkel ein, bis die Nadel das obere Ende des Muskels erreicht.
HINWEIS: Die Injektion in die Mitte des Muskels ist das Ziel. - Drücken Sie langsam den Kolben, während Sie die Nadel langsam entlang des Injektionspfades zurückziehen, um 50 μL Plasmidlösung zu liefern. Der Muskel sollte anschwellen.
- Stellen Sie den Timer auf 1 min und messen Sie die Dicke des Beines am TA. Je nach Größe der Maus kann dies zwischen 5-10 mm liegen. Stellen Sie die Bremssattelelektroden auf die gemessene Dicke ein und stellen Sie die Elektroporatorspannung auf 12,5 V/mm ein.
- Legen Sie nach 1 min die Bremssattelelektroden um die untere Extremität. Die Elektroden sollten eng anliegen, aber nicht zu dicht sein. Liefern Sie 5 Rechteckwellenimpulse mit 20 ms Dauer und 200 ms Intervallen (der Muskel sollte bei jedem Puls zucken).
- Wiederholen Sie dies mit dem alternativen Glied unter Verwendung des Kontrollvektors.
- Entfernen Sie die Maus aus der Narkose und lassen Sie sie sich auf einem auf 37 ° C eingestellten Heizkissen erholen. Nach der Wiederherstellung bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück.
3. EDL-Injektion / Elektroporation
- Mit der Maus in Rückenlage lokalisieren Sie den vorderen Kamm des Tibiaknochens visuell und durch sanfte Palpation.
- Machen Sie mit einem Skalpell einen flachen Schnitt durch die Haut auf der lateralen Seite des Tibia-Vorderkamms, der dem Knie um 5 mm unterlegen ist, um 2 mm über der TA-myotendinösen Verbindung zu sein.
- Mit einer kleinen Schere die Faszie stumpf sezieren und den TA-Muskel freilegen.
- Trennen Sie den TA-Muskel vorsichtig von der Tibia, indem Sie den Muskel seitlich ziehen und die EDL freilegen. Kleine, gekrümmte Pinzetten können verwendet werden, um die TA während des Eingriffs von der EDL fernzuhalten.
- Führen Sie die Nadel mit einer 50-μL-Mikrospritze mit einer abnehmbaren 30-G-Nadel in Längsrichtung in die EDL ein, bis die Nadel das obere Ende des Muskels erreicht.
- Drücken Sie langsam den Kolben, während Sie die Nadel langsam entlang des Injektionspfades zurückziehen, um 10 μL der Plasmidlösung zu injizieren (der Muskel sollte anschwellen).
- Stellen Sie einen Timer für 1 min ein und messen Sie die Dicke des Beines am EDL. Je nach Größe der Maus kann dies zwischen 5-10 mm liegen. Stellen Sie die Bremssattelelektroden auf die gemessene Dicke ein und stellen Sie die Elektroporatorspannung auf 12,5 V/mm ein.
- Legen Sie nach 1 min die Bremssattelelektroden um die untere Extremität. Die Elektroden sollten eng anliegen, aber nicht zu dicht sein. Liefern Sie 5 Rechteckwellenimpulse mit 20 ms Dauer und 200 ms Intervallen (der Muskel sollte mit jedem Puls zucken).
- Schließen Sie den Einschnitt mit Einweg-4/0-nicht resorbierbaren Nylonnähten.
- Wiederholen Sie dies mit dem alternativen Glied oder lassen Sie das Glied als absolute Kontrolle unberührt.
- Entfernen Sie die Maus aus der Narkose und lassen Sie sie sich auf einem auf 37 ° C eingestellten Heizkissen erholen. Verabreichen Sie ein geeignetes subkutanes Analgetikum unmittelbar nach der Operation und 12-24 h nach der Operation. Nach der Wiederherstellung bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück.
HINWEIS: Frühere Studien haben ein Muskelkontraktilitätsdefizit in der TA unmittelbar nach der Elektroporation gezeigt und dass die kontraktile Erholung im Laufe von 3 Tagenauftritt 13,15. Aus diesem Grund wird die Analyse der TA- und EDL-Muskeln auf Histologie, Proteinexpression oder Muskelkontraktilität 3-10 Tage nach der Elektroporation durchgeführt. Eine verlängerte Expression von EGFP wurde bis zu 3 Wochen nach dem Verfahrenbeobachtet 13.
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Representative Results
Elektroporation zur Erleichterung des Gentransfers in der Skelettmuskulatur ist eine nützliche Technik, um Veränderungen in der Muskelphysiologie zu bewerten. Wir haben ein detailliertes, schrittweises Verfahren demonstriert, um einen effizienten Gentransfer sowohl in den TA- als auch in den EDL-Muskeln zu erreichen. Unterschiede in der Transfektionseffizienz treten aufgrund einer Reihe von Variablen auf. Zu diesen Variablen gehören Elektroporationsparameter (Impulse, Spannung, Pulsdauer usw.), die Größe des Genkonstrukts und die Konzentration / das Volumen der injizierten DNA. Wir haben bereits gezeigt, dass Elektroporationsparameter von 5 Pulsen bei 125 V/cm, mit einer Dauer von 20 ms getrennt durch Intervalle von 200 ms, ausreichen, um einen effizienten Gentransfer in der TA14 zu erreichen. Wir zeigen auch in der aktuellen Studie, dass die Injektion / Elektroporation von DNA keinen Verlust der Muskelkontraktilität in der EDL 3 Tage nach dem Experiment verursacht.
Um den Gentransfer zu visualisieren, wurde ein pcDNA3-EGFP- oder pcDNA3 (Kontroll-) Konstrukt in den TA- oder EDL-Muskel der Maus elektropoliert. 3 Tage nach dem Eingriff wurde die TA oder EDL sorgfältig seziert, in OTC-Medien (Optimal Cutting Temperature) gegeben und in flüssigem, stickstoffgekühltem Isopentan (2-Methylbutan) schockgefroren, wie zuvor beschrieben14,17,18,19. 10 μm Muskelschnitte wurden mit einem Kryostaten aus dem Mittelbauch jedes Muskels erhalten. Die Abschnitte wurden dann 5 min lang in 1% Paraformaldehyd inkubiert, gefolgt von 3-5 min Waschungen in PBS. Abschnitte wurden dann in Weizenkeim-Agglutinin inkubiert, konjugiert mit Texas Red, verdünnt 1:100 in PBS für 90 min im Dunkeln. Die Abschnitte wurden erneut in PBS 3 Mal für jeweils 5 Minuten gewaschen. Muskelschnitte wurden dann in wässrige Montagemedien gesteckt und in der Wellenlänge von 594 nm (rot) abgebildet, um die einzelnen Muskelfasern zu visualisieren, und in 480 nm Wellenlänge, um GFP zu erkennen (Abbildung 1A). Die mit pcDNA3 injizierten Kontrollmuskeln wurden in beiden Kanälen mit den gleichen Belichtungseinstellungen zur Kontrolle der potenziellen Autofluoreszenz abgebildet. Muskeln, die mit EGFP injiziert / elektropoliert wurden, zeigten positive grüne Fasern, was die Aufnahme des pcDNA3-EGFP-Konstrukts zeigte, während Muskeln, die mit pcDNA3 (Kontrolle) injiziert / elektroporatet wurden, keine grünen positiven Fasern zeigten. Wir und andere haben bereits gezeigt, dass die Myofaser-Querschnittsfläche nicht durch die GFP-Expression beeinträchtigt wird, indem wir GFP-positive Fasern (grün) mit Nicht-GFP-exprimierenden Fasern (schwarz) innerhalb derselben Muskelabschnitteverglichen haben 4,6,19. Bei einer geringeren Vergrößerung wird die EDL-Muskeltransfektionseffizienz durch das Auftreten von grünen Fasern (positiv) gegenüber schwarzen Fasern (negativ) visualisiert (Abbildung 1B). Die Transfektionseffizienz mit diesem Verfahren betrug 56,6% ± 4,7%, gemessen in 3 EDL-Muskeln. Diese Daten zeigen, dass die Injektion und Elektroporation des TA-Muskels für einen effizienten Gentransfer ausreicht. Darüber hinaus bewirkt die Injektion und Elektroporation des EDL eine effiziente Aufnahme von Genkonstrukten.
Ein wichtiges Werkzeug zur Beurteilung der Skelettmuskelphysiologie ist die Messung der Muskelkontraktilität. Frühere Forscher haben gezeigt, dass die Kontraktilität der in situ gemessenen TA frühzeitig nach der Injektion und Elektroporation der Hintergliedmaßebeeinträchtigt sein kann 13. Um zu testen, ob die EDL-Kontraktilität nach Injektion und Elektroporation beeinträchtigt ist, haben wir die EDL chirurgisch exponiert, mit pcDNA3-EGFP injiziert oder konstruiert und das Hinterbein elektropoliert. Als Kontrolle wurde das alternative Glied zum Vergleich unberührt gelassen. Die Mäuse wurden 3 Tage später eingeschläfert, und die EDL-Kontraktilität des gesamten Muskels wurde mittels Feldstimulation in einem physiologischen Bad gemessen, wie zuvor beschrieben 14,19,20,21. Kurz gesagt, die EDL wurde seziert, und die Sehnen wurden über 4/0 Seidennaht an Edelstahlhaken gebunden und zwischen einem Kraftaufnehmer und einer statischen Basis aufgehängt. Die Muskeln wurden in Tyrode-Puffer gebadet, einer physiologischen Badelösung (121 mM NaCl, 5,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,5 mMMgCl 2, 0,4 mM NaH2 PO4, 24 mMNaHCO3, 0,1 mM EDTA, 5,5 mM Glukose) und während des gesamten Eingriffs mit 100% Sauerstoff gesprudelt. Die Muskelkontraktion wurde mit Platinelektroden stimuliert, um einen supramaximalen Reiz zu liefern. Die optimale Muskellänge (Lo) wurde angepasst, um zu Beginn des Eingriffs die maximale Kraft zu erzielen. Die Kraft-Frequenz-Beziehung wurde unter Verwendung von Stimulationsfrequenzen zwischen 1-150 Hz (0,5 ms Impulse bei supramaximaler Spannung) bestimmt. Der Muskel durfte sich zwischen jeder Stimulation für 3 Minuten entspannen. Nachdem der Stimulationsvorgang abgeschlossen war, wurden das Gewicht und die Länge des Muskels gemessen. Die spezifische Kraft wurde berechnet, indem die absolute Kraft auf die gesamte Muskelquerschnittsfläche, die als Gewicht dividiert durch die Länge berechnet wird, und unter Verwendung der zuvor ermittelten Muskeldichtekonstante (1,056 kg/m−3)21 berechnet wurde. Wir haben gezeigt, dass repräsentative injizierte und elektropolierte EDLs ähnliche tetanische Reaktionen bei 100 Hz im Vergleich zu nicht injizierten oder elektropolierten Kontrollmuskeln aufweisen (Abbildung 2A und Abbildung 2B). Wir fanden heraus, dass die tetanische Muskelkraft, die spezifische Tetankraft, die Zeit bis zur Spitzenspannung und die halbe Entspannungszeit in der injizierten und elektropolierten EDL im Vergleich zur unberührten Kontrolle nicht beeinträchtigt wurden (Tabelle 1). Unsere Daten zeigen, dass die Proteinexpression, die die Kontraktilität beeinflusst, durch Elektroporation in der EDL moduliert werden kann, ohne nachteilige Auswirkungen zu verursachen.
Abbildung 1: Die Elektroporation von pcDNA3-EGFP ist ausreichend für die DNA-Aufnahme in TA- und EDL-Muskeln. A) Repräsentative Querschnitte aus TA- und EDL-Kontrollen (injiziert mit Kontrollvektor und elektropoliert 125 V/cm) und GFP (injiziert mit pcDNA3-EGFP und elektropoliert 125 V/cm). Maßstabsleiste 50 μm. B) Repräsentativer Querschnitt aus der EDL, der die Transfektionseffizienz demonstriert. Maßstabsleiste 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Injektion und Elektroporation beeinträchtigen die Muskelfunktion nicht. Repräsentative tetanische Kraftkurven bei 100 Hz von A) nicht injizierter/elektroporated EDL (Kontrolle) und B) injizierter/elektroporated EDL (GFP). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Steuerung (n=3) | GFP (n=3) | p-Wert | |
| FO (g) | 34.13 ± 1.15 | 35,87 ± 1,55 | 0.1918 |
| sFO (kN/m2) | 691,56 ± 45,80 | 660,00 ± 33,61 | 0.3917 |
| TTP (Sek.) | 0,249 ± 0,0203 | 0,247 ± 0,0197 | 0.9084 |
| RT1/2 (Sek.) | 0,035 ± 0,0035 | 0,033 ± 0,0031 | 0.6458 |
| Kontrolle -nicht injiziert/nicht elektroporiert; GFP-injiziert mit pcDNA3-EGFP und elektroporiert. Werte sind Mittelwert ± SD. p=0,05 als signifikant angesehen. F0- Rohe tetanische Kraft bei 100Hz, sF 0-Tetanic Specific Force bei 100Hz, TTP- Zeit bis zum Höhepunkt bei 1Hz, RT1/2- Zeit bis zur halben Entspannung bei 1Hz. | |||
Tabelle 1: Kontraktilität des gesamten Muskels aus der Kontrolle im Vergleich zu elektropolierten EDLs. Tabelle, die zeigt, dass unterschiedliche Muskelkraftparameter bei injizierten/elektropolierten EDLs (GFP) im Vergleich zu nicht injizierten/nicht elektroporated Kontrollen nicht beeinträchtigt werden. F0 = Tetankraft bei 100 Hz, sF0 = spezifische Tetankraft bei 100 Hz, TTP = Zeit bis zur Spitzenspannung bei 1 Hz, RT1/2 = halbe Entspannungszeit. T-Test des Schülers; Signifikanz bei p = 0,05. n = 3.
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Discussion
Der In-vivo-Gentransfer in der Skelettmuskulatur, der durch Elektroporation verstärkt wird, ist ein nützliches und relativ einfaches Werkzeug zur Modulation der Proteinexpression im Muskel. Wir haben die Schritte gezeigt, die erforderlich sind, um einen effizienten Gentransfer in den EDL- und TA-Muskeln zu erreichen, und gezeigt, dass die Kontraktilitätsmessung der EDL nach dem Verfahren praktikabel ist. Diese Technik erfordert keine komplizierteren viralen Vektoren und ermöglicht den Vergleich von transfizierten und nicht transfizierten Muskelfaserquerschnittsbereichen in einem einzelnen Muskel. Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass die Konstruktaufnahmeeffizienz nicht vollständig war und einige Myofasern nicht transfiziert blieben.
Die diskutierten Verfahren beschränken sich nicht auf die Elektroporation von Expressionsvektoren. Wir haben bereits gezeigt, dass Protein-Knockdown erreicht werden kann, indem die gleichen Verfahren befolgt werden, aber entweder siRNA- oder shRNA-Konstrukte in vivo14 verwendet werden. Zusätzlich können Reporterkonstrukte verwendet werden, um die transkriptionelle Aktivität von Zielgenen 2,4,22 zu messen. Diese Werkzeuge ermöglichen die gleichzeitige Manipulation mehrerer Proteine in einem einzigen Skelettmuskel und geben dem Prüfarzt gleichzeitig die Möglichkeit, transkriptionelle Veränderungen einfach zu messen. Die Skelettmuskulatur kann auch mit einem Expressions- oder sh / siRNA-Vektor und einem fluoreszierenden Reporter co-transfiziert werden. Studien haben gezeigt, dass mehr als 95% der Muskelfasern, die einen Vektor aufnehmen, auch einen anderen Vektor23 aufnehmen. Dies ist nützlich, wenn markierte Konstrukte nicht funktionsfähig sind. Ähnliche Experimente können in verschiedenen Muskeln durchgeführt werden, darunter der Soleus, Gastrocnemius, Quadrizeps und Flexor digitorum brevis, unter anderem24. Das Verfahren ist nicht auf Mäuse beschränkt. Ratten wurden ausgiebig für den Muskelgentransfer verwendet, aber Änderungen des Injektionsvolumens, der DNA-Konzentration und der Elektroporationsparameter sollten berücksichtigt werden. Wichtig ist, dass die Effizienz des Gentransfers abnimmt, wenn die Elektroporation auf große Bereiche angewendet wird, und größere Muskeln können mehrere Injektionen erfordern24.
Post-Gentransfer-Tiere können verwendet werden, um eine Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu untersuchen. Die wichtigsten Determinanten für die Wirksamkeit dieses Verfahrens sind die Transfektionseffizienz des gewünschten Konstrukts und die Dauer der Studie. Während eine erhöhte Proteinexpression bis zu 270 Tage nach der Elektroporationbeobachtet wurde 12, haben Studien gezeigt, dass die Expression im Laufe der Zeit abnimmt13,25. Die Einfachheit und Wirksamkeit dieses Verfahrens machen es sehr anwendbar auf das Studium der Skelettmuskelphysiologie.
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Disclosures
B.A.H. und D.L.W machen keine Interessenkonflikte geltend.
Acknowledgments
Nichts
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
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